【摘 要】
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随着我国居民生活水平的不断提升,消费者对猪肉品质的需求也在不断提高。肌内脂肪含量作为目前对肉质评定的指标中的最重要参数之一,适度增加猪肌内脂肪含量可以提高猪肉嫩度、多汁和肉色。肌内脂肪的主要成分是磷脂和甘油三酯,二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol Acyltransferase,DGAT）是生物体内甘油三酯（triglyceride,TAG）合成过程中的关键限速酶,它的主要作用是催
【基金项目】
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国家科技重大专项（2016ZX08006002）；
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随着我国居民生活水平的不断提升,消费者对猪肉品质的需求也在不断提高。肌内脂肪含量作为目前对肉质评定的指标中的最重要参数之一,适度增加猪肌内脂肪含量可以提高猪肉嫩度、多汁和肉色。肌内脂肪的主要成分是磷脂和甘油三酯,二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol Acyltransferase,DGAT）是生物体内甘油三酯（triglyceride,TAG）合成过程中的关键限速酶,它的主要作用是催化二酰甘油与脂肪酸酰基反应生成TAG。肌肉肌酸激酶基因（muscle creatine kinase,MCK）在肌肉组织中特异高表达。因此本实验将获得活性较强的猪MCK启动子片段,克隆猪DGAT1基因,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的肌肉特异的基因打靶载体pLoxP-MCK-DGAT1-neo-tk-Amp,结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,将donor载体与sgRNA-Cas9载体共同电穿孔转入猪胎儿成纤维细胞。取得了如下研究结果:1.以大白猪cDNA为模板,成功克隆DGAT1 CDS序列,并与去除GFP基因后的pEGFP-N1L-MCK载体重组构建得到sMCK-sDGAT1载体,完善转基因表达框架。将sMCK-sDGAT1载体中的表达框架酶切后与pLoxP载体连接,并分别在筛选基因neo的两端连入合成的同源左臂和同源右臂。采用PCR、酶切和测序等方法验证构建的转基因donor载体准确无误。2.采用组织块法得到30日胎龄的原代大白猪胎儿成纤维细胞（PFFs）,冻存备用。绘制其生长曲线,并利用不同浓度的G418药物测定其敏感度。3.利用荧光载体探索电穿孔转染法的最适转染条件,将构建的转基因donor载体和sgRNA-Cas9载体共同电转分离的PFFs中,通过G418和丙氧鸟苷正负筛选出细胞克隆,并通过PCR和测序鉴定出阳性克隆。4.采用Cre酶两次处理阳性细胞克隆,通过Cre/loxp重组系统成功删除loxp序列中间的筛选标记基因neo,最终得到定点无标记的转DGAT1基因PFFs细胞系。综上所述,本研究构建了有效的DGAT1基因打靶载体,并以PFFs为材料,通过电穿孔转染以及正负筛选法获得DGAT1基因敲入PFFs细胞系,为利用体细胞核移植制备高肌内脂肪DGAT1基因定点敲入猪奠定了基础。
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