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目的： 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一类常见的专性胞内寄生原核微生物，能通过多种方式抵抗宿主细胞凋亡以完成自身的繁殖。最新研究表明，PI3K/AKT信号途径介导的MDM2-p53相互作用轴在衣原体的生长发育及其抗凋亡过程中发挥着重要的作用，但其上游机制还不明确。Ct质粒编码的分泌性蛋白pORF5是一种主要的毒力因子，在Ct致病过程中发挥着重要的作用。本研究为探讨Ct质粒蛋白pORF5与宿主细胞凋亡的关系以及其具体凋亡机制是否与PI3K/AKT介导的MDM2-p53相互作用有关，为进一步阐明pORF5在Ct致病机制中的作用提供重要依据。 方法： 将转化pGEX-6p-1/pORF5重组质粒的E.coli XL1-blue菌株，0.2mM IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白。GST-pORF5融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化及PreScission Protease切除GST标签后得到pORF5质粒蛋白，SDS-PAGE和Western blotting分析并鉴定pORF5质粒蛋白。BCA法测定pORF5质粒蛋白浓度，并经多粘菌素B去内毒素处理。用不同浓度（0、5、10、15、25μg/ml）的pORF5刺激HeLa细胞24h及最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞不同时间（0、8、12、24h）后，Western blotting检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平，同时检测p53的蛋白表达水平，并用Hoechst33342及流式细胞术检测最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞最佳时间后凋亡情况；用最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞不同时间（0、5、15、30、60min）后，Western blotting检测AKT、MDM2的磷酸化，并用间接免疫荧光检测最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞最佳时间后MDM2的定位；用20μM PI3K抑制剂LY294002预处理Hela细胞后1h，再用最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞最佳时间后，Western blotting检测MDM2的磷酸化，并用间接免疫荧光检测MDM2的定位。用20μM PI3K抑制剂LY294002和10μM及20μM MDM2抑制剂处理HeLa细胞1h后，最佳浓度pORF5刺激HeLa细胞最佳时间， Western blotting检测p53及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平，Hoechst33342和流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果: 1、Western blotting结果显示：相比于对照组，当pORF5的浓度达10μg/ml时，Bax、p53表达下调，Bcl-2表达上调；且当pORF5的浓度达15μg/ml时，Bax、p53和Bcl-2的变化最明显。用15μg/ml pORF5刺激HeLa细胞不同时间后，相比于对照组，pORF5刺激HeLa细胞8h后，Bax、p53表达下调，Bcl-2表达上调，且在刺激 HeLa细胞24h后，Bax、p53和Bcl-2的变化最明显。Hoechst染色结果显示：pORF5刺激组凋亡率较TNF-α阳性对照组降低25.6%（P<0.001），较未处理组降低6.13%（P<0.001）；流式细胞仪检测结果显示：pORF5刺激组凋亡率较TNF-α阳性对照组降低27.55%（P<0.001），较未处理组降低7.248%（P<0.001）。 2、Western blotting结果显示：MDM2和AKT在pORF5刺激15min后发生磷酸化，且在刺激30min后磷酸化最明显，而总MDM2和总AKT蛋白表达水平不发生改变。PI3K抑制剂LY294002预处理Hela细胞后，MDM2和AKT的磷酸化显著减少。 3、间接免疫荧光结果显示：相比于未处理组，pORF5刺激组MDM2发生核转位进入胞核，加入LY294002抑制剂预处理HeLa细胞后后，MDM2位于细胞质中不发生核转位。 4、MDM2-p53抑制剂Nutlin3a及PI3K抑制剂LY294002分别预处理HeLa细胞后，Western blotting结果显示：相比于对照组，Bax、p53蛋白表达明显上调，Bcl-2表达明显下调。Hoechst染色结果显示：Nutlin3a处理组凋亡率相比于对照组增加了10.47%(P<0.001)，LY294002处理组凋亡率相比于对照组增加了13.02%(P<0.001)；流式细胞仪检测结果显示：Nutlin3a处理组凋亡率相比于对照组增加了6.14%(P<0.01)，LY294002处理组凋亡率相比于对照组增加了7.5%(P<0.01)。 结论: 沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过激活PI3K/AKT信号通路介导的MDM2-P53相互作用轴抑制宿主细胞凋亡。