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背景和目的:食管鳞癌是一种恶性程度高、进展快、易转移的常见恶性肿瘤,由于早期无明显症状、并且易耐药和复发,在当下抗肿瘤治疗已快速发展的情况下,仍是难以治愈的恶性肿瘤之一。且大部分患者在发病时已经出现了广泛转移,导致其临床治疗失败,预后差。因此,寻找与食管鳞癌转移相关的靶点,阐明其分子机制,并以此为突破探寻新的治疗途径迫在眉睫。神经调节蛋白1（Neuregulin-1,NRG1）作为神经调节蛋白家族的一员,通过结合其受体激活下游信号转导参与正常和恶性组织的细胞增殖、侵袭、存活和分化。尽管研究表明NRG1参与多种实体瘤的发生发展,但其在食管鳞癌中的研究甚少。本课题组前期研究证实NRG1通过激活ERBB3-ERBB2/MAPK/PI3K信号轴促进食管鳞癌细胞迁移,但其对转移的影响及作用机制尚不清楚,本研究旨在明确NRG1对食管鳞癌侵袭转移的影响及其分子机制,为食管鳞癌的治疗提供新的理论依据和可能的药物靶标。方法:一、食管鳞癌中NRG1 mRNA表达与DNA拷贝数及启动子甲基化的关系1.TCGA数据库分析食管鳞癌中NRG1 mRNA高表达组和低表达组中NRG1基因DNA拷贝数或启动子甲基化水平,以及二者与NRG1 mRNA表达的线性相关性和统计学显著性。二、NRG1对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及细胞间粘附能力的影响及分子机制1.克隆形成法检测外源性NRG1重组蛋白（PNRG1）对食管鳞癌细胞形态的影响,Transwell、悬挂液滴实验检测PNRG1及NRG1 siRNA（si-NRG1）对食管鳞癌细胞侵袭及细胞与细胞间粘附能力的影响。2.GEPIA数据库分析食管癌中NRG1与NF-κB p65及基质金属蛋白酶家族的相关性。3.核质分离、免疫荧光和Western blot实验检测PNRG1或si-NRG1对食管鳞癌细胞中NF-κB p65核转位及NF-κB/MMP9信号通路相关蛋白表达的影响。4.划痕、Transwell和悬挂液滴实验检测PNRG1存在条件下,NF-κB p65抑制剂PDTC及NF-κB p65 siRNA（si-9）对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及细胞与细胞间粘附能力的影响。Western blot法检测上述处理条件下食管鳞癌细胞中NF-κB/MMP9信号通路及EMT过程相关蛋白的表达情况。三、下调NRG1表达对裸鼠体内食管鳞癌转移的影响1.利用携带萤火虫荧光素酶基因的慢病毒表达载体感染KYSE150细胞系,构建稳定敲降NRG1的细胞及其阴性对照细胞。Western blot检测稳转细胞系中NRG1的表达水平及NF-κB/EMT信号通路相关蛋白的表达情况;划痕、Transwell和悬挂液滴实验验证稳定下调NRG1对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及细胞间粘附能力的影响。2.小动物活体成像实验评估上述细胞的生物发光效率。3.尾静脉注射上述肿瘤细胞,构建裸鼠体内食管鳞癌转移模型,每日监测并记录裸鼠体重,小动物活体成像实验检测下调NRG1表达对裸鼠体内食管鳞癌转移的影响。H＆E染色鉴定裸鼠肺部食管鳞癌转移灶,并对转移灶点数进行统计。结果:一、食管鳞癌中NRG1 mRNA高表达与DNA拷贝数增加有关1.TCGA数据库分析结果显示NRG1在食管鳞癌中的DNA拷贝数水平和NRG1 mRNA表达呈现显著的正相关,且与NRG1 mRNA低表达组相比,高表达样本组中DNA拷贝数水平更高。而NRG1 DNA启动子甲基化状态与NRG1 mRNA表达无关。二、NRG1通过激活NF-κB/MMP9信号通路促进食管鳞癌细胞迁移、侵袭,抑制细胞与细胞间粘附能力1.PNRG1能促进食管鳞癌细胞形态由紧密连接的鹅卵石状上皮细胞形态转变成更易游走的梭形,并且使细胞间连接变的松散。PNRG1能促进食管鳞癌细胞侵袭并抑制细胞与细胞间粘附,而si-NRG1能抑制食管鳞癌细胞侵袭并促进细胞与细胞间粘附作用。2.GEPIA数据库分析结果显示NRG1与NF-κB p65、MMP9及MMP10呈显著的正相关,而与MMP2、MMP7、MMP13无相关性。3.PNRG1能诱导NF-κB p65入核,促进食管鳞癌细胞中p-IKKα/β（Ser176/180）、p-IκBα（Ser32/36）、p-NF-κB p65（Ser536）的表达并上调 MMP9 蛋白的表达,而si-NRG1能抑制NF-κB p65入核,下调上述蛋白的表达。4.PDTC或si-9均能削弱PNRG1对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的促进作用,并逆转PNRG1对食管鳞癌细胞与细胞间粘附的抑制作用。Western blot实验结果表明PDTC或si-9均能阻断由PNRG1引起的NF-κB/MMP9信号通路的激活及EMT进程。三、下调NRG1表达降低食管鳞癌细胞在裸鼠体内的转移能力1.成功构建携带萤火虫荧光素酶基因并稳定敲降NRG1的细胞及其阴性对照细胞,下调NRG1能抑制食管鳞癌细胞迁移、侵袭能力,并增强细胞与细胞间粘附能力。2.上述细胞符合体内实验细胞生物发光效率的标准。3.下调NRG1显著抑制裸鼠体内食管鳞癌的肺转移,对照组裸鼠体重从第6周开始下降,且在第8周时对照组裸鼠的体重较NRG1敲低组明显下降。H＆E染色结果显示,NRG1敲低组裸鼠肺部转移灶点数明显少于对照组。结论:NRG1能增强食管鳞癌细胞侵袭、转移能力,其机制与NRG1激活NF-κB/MMP9信号通路从而促进EMT进程有关。