肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在全世界范围内是最常见的致死性恶性肿瘤之一，全球每年约有一百万人死于肝癌，严重威胁着人类健康。在我国肝癌位居癌症发病率第二，死亡率占全部恶性肿瘤死亡率的近五分之一。目前临床上治疗肝癌的一些常规化疗药物（如阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂等）虽然对于某些肝癌病人具有一定的疗效，但其具有毒性大、副作用强等特点，在很大程度上限制了治疗效果。近年来从天然植物中寻找具有抗肿瘤作用的生物活性物质来预防和治疗癌症已经成为国内外研究的热点，例如广泛存在于水果、蔬菜、谷类、药用植物等多种天然植物中的黄酮类化合物。国内外大量研究表明多种黄酮类化合物能够通过抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。本课题研究对象甘草素(Liquiritigenin, LQ)，是从药食同源的天然植物甘草中提取的一种二氢黄酮单体化合物。本实验室前期研究表明甘草素具有抗肿瘤作用，在体外能够有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞和人宫颈癌Hela细胞增殖并且诱导细胞凋亡；进一步的动物实验结果显示，甘草素不仅能抑制小鼠肝癌H22细胞移植瘤生长并且诱导移植瘤凋亡，还能抑制裸鼠人宫颈癌Hela细胞移植瘤生长以及血管生成。在上述研究的基础上，本课题拟通过甘草素与临床广谱抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin, DOX)联合应用，观察其抑制人肝癌HepG2细胞及裸鼠肝癌移植瘤生长和诱导凋亡的作用及其相关分子机制，为进一步阐明天然植物甘草中的黄酮类化合物甘草素的抗肿瘤作用提供科学的理论依据。第一部分甘草素联合阿霉素抑制人肝癌HepG2细胞生长及诱导细胞凋亡作用的研究目的：研究甘草素(LQ)联合阿霉素(DOX)抑制人肝癌HepG2细胞生长及诱导细胞凋亡的作用。方法：阿霉素低剂量(1μM)、高剂量(4μM)单独处理和甘草素低、中、高剂量(100、200、300μM)与阿霉素低剂量(1μM)联合处理HepG2细胞48h后，用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞生长的影响；用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学改变；用Annexin V-PI双染法经流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。结果：甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组的HepG2细胞存活率(79.41%、56.91%、36.91%)明显低于阿霉素低剂量单独应用组(90.43%)(p<0.01)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，细胞存活率降低，具有一定的剂量-效应关系；其中，甘草素高剂量与阿霉素低剂量联合应用组的细胞存活率(36.91%)低于阿霉素高剂量单独应用组(48.39%)。与阿霉素低剂量单独应用组相比，甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组诱导HepG2细胞凋亡发生的形态学变化明显，细胞核出现致密浓染、或呈碎块状致密浓染，并出现蓝色荧光；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，致密浓染或碎片浓染的细胞数增加、蓝色荧光强度增强，具有一定的剂量-效应关系；其中，甘草素高剂量与阿霉素低剂量联合应用组诱导细胞凋亡发生的形态学变化比阿霉素高剂量单独应用组明显。甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组的HepG2细胞凋亡率(10.55%、22.99%、30.69%)明显高于阿霉素低剂量单独应用组(5.04%)(p<0.01)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，细胞凋亡率增高，具有一定的剂量-效应关系；其中，甘草素高剂量与阿霉素低剂量联合应用组的细胞凋亡率(30.69%)高于阿霉素高剂量单独应用组(25.71%)。结论：甘草素与阿霉素联合应用能明显抑制HepG2细胞生长、诱导细胞凋亡，并具有一定的剂量-效应关系。第二部分甘草素联合阿霉素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制研究目的：探讨甘草素(LQ)联合阿霉素(DOX)诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制。方法：阿霉素低剂量(1μM)单独处理或与甘草素低、中、高剂量(100、200、300μM)联合处理HepG2细胞6,12h后，用活性氧检测试剂盒检测ROS的变化。阿霉素低剂量(1μM)单独处理或与甘草素低、中、高剂量(100、200、300μM)联合处理HepG2细胞48h后，用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位(△ψm)的变化；用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测电压依赖型阴离子通道蛋白(VDAC)、cytosolic cytochrome c、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。结果：甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组刺激HepG2细胞产生的ROS明显多于阿霉素低剂量单独应用组(p<0.01)；且联合应用组中随着时间的延长和甘草素剂量的增加，产生的ROS增多，具有一定的时间-效应和剂量-效应关系；其中，甘草素高剂量与阿霉素低剂量联合应用组刺激HepG2细胞产生的ROS多于阳性对照组(Rosup)。甘草素中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组HepG2细胞中的VDAC蛋白表达高于阿霉素低剂量单独应用组(p<0.05)；甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组比阿霉素低剂量单独应用组HepG2细胞中的线粒体膜电位(△ψ m)低(p<0.05)、细胞浆内细胞色素C多(p<0.01)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，VDAC蛋白表达增加、△ψ m降低、细胞浆内细胞色素C增多，具有一定的剂量-效应关系。甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组比阿霉素低剂量单独应用组HepG2细胞中的Caspase-9和Caspase-3的前体裂解多、表达低(p<0.01、p<0.05)，裂解形式多；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，Caspase-9和Caspase-3的前体裂解增多、表达降低，裂解形式增多，具有一定的剂量-效应关系。甘草素低、中、高剂量与阿霉素低剂量联合应用组比阿霉素低剂量单独应用组HepG2细胞中的Bcl-2表达低、Bax表达高、Bax/Bcl-2比值大(p<0.01)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，Bcl-2表达下调、Bax表达上调、Bax/Bcl-2比值增大，具有一定的剂量-效应关系。结论：甘草素与阿霉素联合应用可通过促进ROS的产生，激活线粒体凋亡途径从而诱导HepG2细胞凋亡。第三部分甘草素联合阿霉素抑制裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤生长及诱导凋亡的研究目的：研究甘草素(LQ)联合阿霉素(DOX)抑制裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤生长及诱导移植瘤凋亡的作用。方法：建立裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤模型。40只裸鼠随机分为5组，每组8只：空白对照组、阿霉素单独应用组(1mg/kg)、甘草素低、中、高剂量(5、10、20mg/kg)与阿霉素(1mg/kg)联合应用组。实验期间每隔一天称量裸鼠体重、测量移植瘤体积，绘制裸鼠体重变化曲线、移植瘤生长曲线。24天后处死裸鼠，剥取移植瘤组织称量，甲醛固定、石蜡包埋，用苏木素—伊红染色(HE)法观察移植瘤组织病理学变化、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测移植瘤组织凋亡，用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测移植瘤组织中VDAC、cytosolic cytochrome c、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。结果：成功建立裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤模型。各组裸鼠体重给药前后无显著性差异。甘草素低、中、高剂量与阿霉素联合应用组比阿霉素单独应用组的移植瘤瘤体小、瘤重量轻(p<0.05)、瘤体积小(p<0.01)、移植瘤生长曲线增长幅度小；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，移植瘤瘤体减小、瘤重量减轻、瘤体积减小、生长曲线增长幅度减小，具有一定的剂量-效应关系。甘草素低、中、高剂量与阿霉素联合应用组比阿霉素单独应用组的移植瘤细胞不规则坏死灶面积大、凋亡特征明显、凋亡指数(AI)高(p<0.01)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，移植瘤细胞不规则坏死灶面积增大、凋亡特征逐渐明显、凋亡指数(AI)增高，具有一定的剂量-效应关系。甘草素中、高剂量与阿霉素联合应用组移植瘤组织中的VDAC蛋白表达高于阿霉素单独应用组(p<0.01)；甘草素低、中、高剂量与阿霉素联合应用组移植瘤组织中的细胞浆内细胞色素C多于阿霉素单独应用组(p<0.05)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，VDAC蛋白表达上调、细胞浆内细胞色素C增多，具有一定的剂量-效应关系。甘草素低、中、高剂量与阿霉素联合应用组比阿霉素单独应用组移植瘤组织中的Caspase-9和Caspase-3的前体裂解多、表达低(p<0.01、p<0.05)，裂解形式多；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，Caspase-9和Caspase-3的前体裂解增多、表达降低，裂解形式增多，具有一定的剂量-效应关系。甘草素低、中、高剂量与阿霉素联合应用组比阿霉素单独应用组移植瘤组织中的Bcl-2表达低、Bax表达高、Bax/Bcl-2比值大(p<0.05)；且联合应用组中随着甘草素剂量的增加，Bcl-2表达下调、Bax表达上调、Bax/Bcl-2比值增大，具有一定的剂量-效应关系。结论：甘草素与阿霉素联合应用能明显抑制裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤生长，并可通过激活线粒体凋亡途径诱导移植瘤凋亡。