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由于移植排斥反应的存在,T细胞对于同种细胞的应答通常被认为是有害的。然而伴随移植物抗宿主病(GVHD)发生的移植物抗白血病反应/移植物抗肿瘤反应,表明了同种反应性T细胞中存在一群有利的细胞,在清除恶性肿瘤中具有巨大作用。我们的前期工作提示同种T细胞与一般抗原反应性T细胞一样,识别的表位均为抗原肽/MHC复合物(pMHC),且均具有pMHC特异性,故在实际应用中有可能根据同种反应性T细胞的不同特异性将有利和不利的同种T细胞区分开。本研究拟在单个pMHC水平上,提供实验依据证实过继单一表位特异性的同种CTL可在体内清除特定性状的靶细胞,同时避免多组织损伤的发生。不仅有利于进一步认识同种反应发生的机制及其规律,而且为利用同种T细胞打破病理性耐受(慢性感染与肿瘤等)提供了新手段。然而由于细胞表面存在极其繁多的pMHC,用传统的方法制备获得的同种反应性T细胞为针对多种表位的细胞群体。因此,本研究通过建立“单一表位特异性同种T细胞诱导体系”制备单一表位特异性同种CTL(胰岛素肽/H-2Kb特异性同种CTL),并过继输入动物体内,攻击表达该pMHC的靶细胞(H-2b小鼠的胰岛β细胞),观察其特异性杀伤效应。论文共分为三部分,其主要内容与结果如下：一、制备H-2Kb/IgG2aFc分子,其能有效结合到C3H小鼠巨噬细胞表面首先通过融合C57BL/6小鼠H-2Kb重链胞外段和IgG2aFc段获得H-2Kb/IgG2aFc融合基因,并与小鼠小鼠β2m基因分别插入杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual的PP10和PPH启动子下游,利用昆虫杆状病毒表达系统表达以二聚体形式存在的β2m/H-2Kb/IgG2aFc分子(简称H-2Kb二聚体)。融合分子中IgG2aFc为高亲和力的Fc,可通过与FcR的相互作用加载H-2Kb二聚体到C3H小鼠巨噬细胞(H-2Kk)表面,使其能够“提呈”单一同种表位(特异性肽/H-2Kb),从而为诱导单一pMHC特异性的同种CTL奠定了基础。二、体内外联合诱导自身/同系淋巴细胞产生胰岛素肽/H-2Kb特异性的同种CTL利用加载了胰岛素肽/H-2Kb二聚体的自身巨噬细胞作为抗原刺激细胞,经过腹腔注射C3H小鼠(H-2Kk),诱导其产生针对胰岛素肽/H-2Kb表位的特异性同种T细胞,收集并对其进行特异性四聚体染色和细胞毒效应检测。结果显示诱导产生的CD8+T细胞特异性四聚体染色频率显著高于非特异性四聚体染色频率；同时,该CTL对具有相应表位(胰岛素肽/H-2Kb)的靶细胞具有明显的杀伤作用,而对无关表位的靶细胞杀伤率极低。三、尾静脉过继诱生的单一pMHC特异性的同种T细胞定向损伤胰岛β细胞将胰岛素肽/H-2Kb特异性CTL由尾静脉分别过继受者C57BL/6小鼠(H-2b)、B6C3F1小鼠(H-2b×k)和SCID beige小鼠(H-2d),过继后监测血糖、胰岛素及淋巴细胞浸润情况。结果显示接受过继后,受者C57BL/6和B6C3F1小鼠第3天便出现明显的血糖升高,胰岛素水平降低并且胰岛出现较明显的β细胞缺如和T细胞浸润；而受者SCID beige小鼠血糖和胰岛素水平未见明显变化,组织未见明显损伤。结果提示过继的单一pMHC特异性CTL能够定向杀伤特定性状的靶细胞。本研究的创新点和意义：1.提供直接的动物体内实验证据显示同种反应的发生机制,即任何抗原肽,只要能够与MHC分子结合,都能够形成同种T细胞的识别表位；同种反应性T细胞与一般抗原反应性T细胞一样,都具有pMHC特异性。2.选用小鼠体内胰岛β细胞损伤作为观察同种CTL效应的指标,研究结果将显示过继特异性同种T细胞是干预病理性免疫耐受的新途径,同时为研究同种反应提供新的技术平台。