月月桂香精油提取研究及其调控基因AACT克隆技术

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月月桂花香淡雅,微黄,四季开花,但其花量少,即使处于盛花阶段,花量也比同类花量少。月月桂花香是众多桂花中最淡的,几乎闻不到花香味,这限制了其观赏及商业应用。因此虽然桂花香精油广泛应用于医药和食品产业,而月月桂精油的提取及商业应用却不常见。本研究发现月月桂香气较淡、香气成分时空表达差异具有较大的缺点,探索月月桂精油提取的最佳工艺,探索月月桂精油工业化提取的可能性,以月月桂精油提取量为衡量指标,优化月月桂石油醚萃取法提取工艺,得到最佳的提取条件。针对月月桂花香较淡的缺点,本研究通过克隆月月桂乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase, AACT)基因全长,并对其进行生物信息学分析,并试图构建AACT植物表达载体,为改善月月桂香气较淡、香气成分时空表达差异探索一条可行的道路。本文还研究了月月桂时空表达特点,为AACT植物表达载体转化受体植物提供理论支撑。实验的主要结果如下:1.利用石油醚萃取月月桂香精油,其最佳提取工艺为:粉碎至20目,料液比为1:5m/v,提取温度为60℃,提取4h。通过GC-MS技术分析检测香精油的香型成分,发现香气成分以醇类、酯类、酸类等物质为主,其中萜类物质占了85%以上,所有成分中角鲨烯的含量最高,为11.5986%,其中的单帖类物质如α-蒎烯、β-罗勒烯、水芹烯、莰烯、芳樟醇等的含量达到16.5957%,而紫罗兰酮和4-羟基-p-紫罗酮香的含量为12.1328%。2.采用RACE技术克隆香精油成分的合成关键酶—乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)的基因,得到的cDNA序列长为1580bp,并对此基因进行生物信息学分析,月月桂AACT开放阅读框在80~1297 bp之间,共编码405个氨基酸;相对分子质量为41347.89 D;等电点为5.66,为疏水性稳定蛋白,属Cond-enzymes超家族,氨基酸序列比对和进化树分析都可以发现,AACT的保守性高,具有可靠性。3.采用AACT基因的半定量表达分析观察AACT基因的组织特异性表达和时空差异表达,分析AACT在月月桂花瓣和叶子中不同季度的表达量水平及不同花期的表达量。基因表达半定量分析结果显示:春夏秋冬四季中月月桂花瓣中AACT的表达量相似度达99%,AACT表达量均为1.0241左右,上下偏差不超过0.0201;月月桂叶子中AACT的表达量随着季节的转换逐渐降低,AACT量从3月份的0.7740一直降为0.1200;同一季节,月月桂花瓣中AACT的表达量远远高于叶子中AACT的表达量,且随着季节变化差距越来越大,3、6、9、12月份月月桂花和叶子的AACT表达量差距分别在0.3、0.4、0.6、0.9,显著性明显;不同开花期的AACT的表达量相差较大,初花期的月月桂花瓣AACT表达量最高,AACT表达量为0.9左右,而凋谢期中AACT表达量最低为0.4左右。4.利用BamH1-Kpn1双酶切和T4连接酶,将1218bp的AACT基因插入11633bp的pCMBIA2301质粒中,得到CaMV35s启动子驱动的OsAACT表达的植物表达载体,其长度约12848bp。
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