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抗生素滥用导致多种细菌产生耐药性,其中铜绿假单胞菌作为医院内感染中存在的最广泛的致病菌,由于其内源性耐药以及适应性耐药机制,使得传统药物已无法解决多药耐药铜绿假单胞菌使宿主产生的多种急性和慢性感染,正在成为世界范围的公共健康威胁。群体感应系统是一种具有调控细菌间通信能力的通讯机制,与铜绿假单胞菌严重的感染性和致病性有着密不可分的关系。抗菌肽是天然免疫的重要组成部分,也是目前解决细菌耐药的主要研究热点。本实验室前期以富含赖氨酸/亮氨酸残基的中国林蛙皮肤抗菌肽L-K6为模板,通过序列中不同位置的色氨酸残基的替换,设计并合成了 7个在不同位置含有色氨酸的抗菌肽,实验室前期实验结果证明其对从临床中分离的多种多药耐药细菌菌株具有高的体外体内抗菌活性,并且可以与MRPA0108外膜上的LPS相互作用,插入到细胞外膜。除此之外,含色氨酸系列抗菌肽还可以通过降低MRPA0108细胞膜外排泵基因的表达,减少MRPA0108对抗生素的外排。而研究表明细菌外排泵、生物被膜(Biofilm)形成等都与细菌群体感应系统有密切的关系,因此本文重点研究了这些抗菌肽对临床分离的多药耐药铜绿假单胞菌MRPA0108群体感应系统的作用机制,为抗菌肽抵抗多药耐药菌的感染和侵袭提供更多理论基础。通过激光共聚焦扫描显微镜观察到含色氨酸系列抗菌肽可以进入MRPA0108细胞的核质区,与核DNA共定位。DNA凝胶阻滞实验证明,含色氨酸系列抗菌肽能够与MRPA0108细胞的基因组DNA结合,其中L5W与DNA结合能力最强,在比例为0.62/1时发生结合;I4W和I1WL5W与DNA的结合差,在比例为2.5/1时发生结合。核酸紫外吸收光谱和圆二色谱(CD)实验进一步显示含色氨酸系列抗菌肽能够与MRPA0108基因组DNA相互作用产生增色效应,提示肽插入DNA分子的凹槽中,导致原本致密的DNA的双螺旋结构松动。但是当L5W/DNA和I1WL5W/DNA比例增加到1.25/1和2.5/1时,会发生减色效应并伴随着红移现象,提示高浓度抗菌肽所带的正电荷通过与DNA之间的静电结合使DNA分子的轴向空间收缩,导致构象变化。RT-qPCR实验证明含色氨酸系列抗菌肽可以下调MRPA0108细胞中DNA复制起始基因dnaA,dnaB和dnaC的表达。该研究提示含色氨酸系列抗菌肽可能是通过靶向胞内DNA而杀灭细菌的。RT-qPCR实验结果显示低浓度的含色氨酸系列抗菌肽,能够抑制MRPA0108群体感应系统中毒力因子调控基因lasA、lasB、rhlA和rhlB的表达,其中对rhlA和rhlB基因表达的抑制作用大于lasA和lasB。通过弹性蛋白-刚果红法和偶氮酪蛋白法分别检测了含色氨酸系列抗菌肽对MRPA0108群体感应系统中las系统调控的毒力因子弹性蛋白酶和碱性蛋白酶活性的影响。结果表明,含色氨酸系列抗菌肽在浓度为1/4 MIC时能够抑制这两种蛋白酶的活性,对弹性蛋白酶活性抑制率为12-28%,对碱性蛋白酶活性的抑制率为18-44%。此外,通过氯仿萃取法和苔黑酚法分别检测了含色氨酸系列抗菌肽对MRPA0108群体感应系统中rhl系统调控的毒力因子绿脓菌素和鼠李糖脂释放的影响。结果显示含色氨酸系列抗菌肽能够抑制绿脓菌素的释放,其中I1W、L5W、L12W在浓度为1/4 MIC时对绿脓菌素释放的抑制率分别为73.7%、69.4%、63.1%,其余抗菌肽对绿脓菌素的抑制率在55%左右;I1W、I4W对鼠李糖脂释放的抑制率约为45.2%和43.9%。此结果和RT-qPCR的实验结果相一致,提示含色氨酸系列抗菌肽对rhl系统调控的毒力因子的抑制作用要好于对las系统调控的毒力因子的抑制作用。铜绿假单胞菌群体感应系统中rhl系统调控产生的鼠李糖脂和绿脓菌素与其Biofilm的形成有着密不可分的关系。激光共聚焦显微镜观察了含色氨酸系列抗菌肽I1W、I4W和L5W对MRPA0108 Biofilm形态的影响,通过与对照组Biofilm(厚度为6 μm)比较,发现I1W、I4W和L5W能够显著降低MRPA0108 Biofilm的厚度(厚度在1.5-2 μm),提示I1W、I4W和L5W能抑制MRPA0108 Biofilm的形成。结晶紫染色法和RT-qPCR实验进一步定量检测了含色氨酸系列抗菌肽对MRPA0108 Biofilm形成的影响。结果显示,含色氨酸系列抗菌肽能够明显抑制MRPA0108 Biofilm的形成,且呈有浓度依赖关系。I1W和I4W的浓度为1/4 MIC时对Biofilm形成的抑制率分别为33.9%和40.7%。而含色氨酸系列抗菌肽对已经形成1天的Biofilm的分解作用较小,在浓度为1/4MIC时分解率在15-22%之间。接下来检测Biofilm组分胞外聚合物(EPS)、psl多糖和藻酸盐的含量变化,结果表明含色氨酸系列抗菌肽能明显抑制EPS的合成,且随着抗菌肽浓度升高,抑制作用逐渐增强。I1W浓度为1/4MIC时,对MRPA0108EPS生成的抑制作用为26.3%。含色氨酸系列抗菌肽能够明显降低藻酸盐的含量,I1W和I4W抑制效果较好,在1/4 MIC时抑制率为53%和47%。RT-qPCR实验进一步表明含色氨酸系列抗菌肽能抑制Biofilm组分基因的表达。以上结果表明含色氨酸系列抗菌肽可以通过抑制MRPA0108群体感应系统中的rhl系统,降低毒力因子绿脓菌素、鼠李糖脂以及集群运动,从而抑制了 Biofilm的形成。