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食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其发生是多因素作用、多基因参与、多阶段共同发展的疾病，然而其发生发展的确切机制尚不明确。我国是世界上食管癌死亡率最高的国家之一，每年有不少人死于食管癌。由于其早期症状不明显，不易察觉，到确诊时已属中晚期，故预后较差。尽管近些年来通过普查使得食管癌早发现早诊断早治疗的水平有所提高，食管癌的预后有所改善，但五年生存率仍较低。因此，继续寻找新的抗肿瘤药物，并了解其在肿瘤发生发展过程中作用的信号转导通路成为食管癌临床治疗研究的重点。本实验主要研究了ERK信号转导通路，即Ras-Raf-MEK-ERK三级酶促级联反应，并通过转染高活性MEK质粒来研究食管癌细胞中ERK/p-ERK及细胞迁移能力的变化，进而得知高活性MEK质粒对人食管癌细胞中ERK信号通路的生物学作用，通过使用Bufalin（即蟾蜍灵，是从中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物提取的主要活性成分之一，属于一种强心苷类物质，已被用来作为一种传统的中医治疗感染、肿瘤以及麻醉）来有效的阻断通路信号的异常传导，降低各个因子的活化水平，从而达到抑制肿瘤因子异常增殖和迁移的作用。Bufalin在临床上多有报道，但尚未应用于食管癌的治疗，本实验室的前期实验证实，Bufalin可通过ERK信号转导通路来下调细胞内p-Raf、p-MEK、p-ERK的水平，而Raf、MEK、ERK则无明显变化，提示Bufalin可能通过抑制ERK通路中各个因子的活化达到抑制食管癌发生发展的作用。本实验就此在Bufalin对人食管癌细胞中ERK/p-ERK和细胞迁移能力的影响方面进行研究，从而多方面验证Bufalin在食管癌中的作用，为临床能够更好的治疗食管癌提供可靠的实验依据与新的治疗方向。为了更好的研究食管癌发生发展的具体机制以及治疗食管癌的方案，本实验继续使用了食管癌细胞株TE13进行人体外的研究，旨为了解在食管癌发生发展过程中Bufalin在ERK通路中所发挥的具体作用，并为更好的服务于临床打下坚实的基础。目的：探讨Bufalin对人食管癌细胞ERK/p-ERK和细胞迁移能力的影响方法：1将携带高活性MEK基因的质粒转化至DH5α大肠杆菌中进行扩增，并使用脂质体法将携带高活性MEK基因的质粒成功转染到食管癌TE13细胞中，使用Western Blot方法分别检测转染质粒0h、24h、30h、36h、42h、48h后细胞内ERK表达及其活化情况的变化，并得出转染的最佳时间。2用Western Blot方法分别检测不同处理组（对照组、空载体转染组、高活性MEK质粒转染组、转染后加Bufalin组）中细胞内ERK及其活化情况的蛋白表达，进而研究转染高活性MEK质粒及Bufalin对ERK通路的影响。3采用细胞划痕实验分别测量不同处理组（普通培养组、空载体转染组、高活性MEK质粒转染组、转染后加Bufalin组、转染后加Uo126组、Bufalin和Uo126联合应用组）36h后细胞迁移的距离，并与对照组作比较，进而研究不同处理组对细胞迁移能力的影响。结果：1成功将高活性MEK质粒扩增并转染到食管癌细胞中，并检测到其下游基因ERK在不同处理组间蛋白水平无明显变化（0.542±0.015，0.687±0.020，0.576±0.019，0.579±0.016，0.475±0.011，0.611±0.006，P＞0.05），无显著性差异。而p-ERK在对照组和空载体组中亦无明显变化，但在高活性MEK质粒转染组中的活化水平明显升高，且随转染后时间的增加（0h、24h、30h、36h）表达量逐渐升高，至36小时达到最高值，此后（42h、48h）表达量开始下降（0.756±0.035，0.663±0.040，0.714±0.053，1.314±0.053，0.663±0.034，0.704±0.009，P＜0.05），差异具有统计学意义。2Western Blot结果显示：转染高活性MEK质粒36h后，ERK蛋白的表达在不同处理组间无明显差别（0.800±0.003，0.714±0.034，0.759±0.022，0.750±0.026，P＞0.05），而ERK的活化水平p-ERK在转染组的表达明显高于对照组和空载体组，当转染后加入Bufalin后，p-ERK的水平又受到抑制，明显下降（0.381±0.026，0.400±0.017，0.698±0.010，0.432±0.007，P＜0.05），差异具有统计学意义。3划痕实验结果显示：不同的处理组在划痕36h后与对照组相比迁移的距离不同，在高活性MEK质粒转染组明显大于其他各组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而Bufalin和Uo126联合应用组细胞迁移的距离又明显低于单纯应用Bufalin和Uo126组，差异具有统计学意义（P＜0.05），Bufalin组和Uo126组差异不明显（P＞0.05）（4.100±0.200，4.200±0.265，10.333±0.252，6.683±0.058，7.033±0.158，3.933±0.153）。结论：1直接转染高活性的MEK质粒可进一步激活其下游的ERK，使p-ERK的水平升高，且在转染后36h时活化水平达到最高值。而ERK的表达并不受转染时间的影响。2转染高活性MEK质粒可以使细胞内p-ERK的水平明显升高，加入Bufalin后又可以显著抑制ERK的活化，使p-ERK的水平又降低。而ERK的表达在不同处理组间无明显变化。3Bufalin对食管鳞状细胞癌TE13细胞株的迁移能力具有明显的抑制作用。