论文部分内容阅读
【背景和目的】目前普遍认为HBx蛋白在HBV相关肝癌的发生发展中发挥重要的作用,但是其确切机制还不完全清除。而在肝癌发生中,局部肿瘤微环境中存在着营养相对不足的情况,这种饥饿的环境不但参与了肿瘤的发展,而且与肝癌细胞内的线粒体自噬水平存在着正比的关系。另外一方面,肿瘤细胞中线粒体自噬、线粒体未折叠蛋白反应、细胞凋亡存在着千丝万缕的联系,共同影响肿瘤的发生发展。所以本课题致力于研究HBx蛋白对营养缺乏的肝癌细胞的影响及其机制。【方法】1.Hep G2细胞用lipo3000共转染GFP-LC3和pc DNA3.1-flag-hbx,转染后48h用EBSS饥饿处理,然后做Mitotracker Red线粒体染色,制成玻片标本,在共聚焦显微镜下观察绿色LC3点和红色线粒体的共定位情况,以此比较HBx组和Mock(pc DNA3.1-空载)组的线粒体自噬水平。2.Hep G2细胞分别用hbx-Ad和GFP-Ad腺病毒感染,并做饥饿处理,然后提取细胞总蛋白、2种不同方法提取线粒体、提取去除线粒体的胞浆蛋白,再分别用Western blot检测相应部分蛋白的PINK1、Parkin以及Lonp1蛋白的表达水平,比较各组分HBx组和Mock组目的蛋白的表达水平。3.Hep G2细胞分别用hbx-Ad和GFP-Ad腺病毒感染,并做饥饿处理,然后用Annexin V-FLUOS/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较HBx组和Mock组的凋亡率。4.用LONP1 sh RNA和NT sh RNA慢病毒感染Hep G2细胞,并提取细胞总蛋白,用Western blot检测PINK1、Parkin以及Lonp1蛋白的表达水平,比较LONP1sh RNA组和LONP1 sh RNA组目的蛋白的表达水平。【结果】1.饥饿Hep G2的细胞荧光染色结果显示,HBx组较Mock组的线粒体自噬水平明显升高(p<0.001);2.饥饿Hep G2的细胞总蛋白Western blot结果显示,HBx组较Mock组PINK1、Parkin蛋白表达水平升高,Lonp1蛋白表达下调(p<0.05);3.饥饿Hep G2细胞的线粒体蛋白Western blot结果显示,用12,000g离心抽提得到的线粒体,HBx组较Mock组线粒体内Parkin蛋白含量增高(p<0.05),同时,去除线粒体的胞浆蛋白部分,HBx组较Mock组的Lonp1蛋白含量下降(p<0.05);4.饥饿Hep G2细胞的线粒体蛋白Western blot结果显示,无论用12,000g还是者3000g离心抽提得到的线粒体,HBx组较Mock组线粒体内Lonp1蛋白含量均增高(p<0.05);5.饥饿Hep G2细胞的线粒体蛋白Western blot结果显示,用3000g离心抽提得到的线粒体,HBx组较Mock组线粒体内Parkin蛋白含量降低(p<0.05);6.饥饿Hep G2的凋亡率检测结果显示,HBx组较Mock组的凋亡率减低,(p<0.05);7.LONP1 sh RNA慢病毒处理Hep G2的细胞总蛋白Western blot结果显示,下调LONP1表达后,Hep G2细胞内PINK1、Parkin表达升高。【结论】1、HBx可以提高饥饿Hep G2细胞的PINK1/Parkin线粒体自噬通路的表达水平,促进Parkin蛋白的线粒体转位,同时降低Lonp1的表达水平,促进线粒体自噬。2、HBx可以促进饥饿Hep G2细胞的线粒体自噬,降低Hep G2细胞的凋亡率。3、HBx可以提高饥饿Hep G2细胞线粒体内Lonp1蛋白酶的含量,提高线粒体未折叠蛋白反应水平。