目的:食管癌是人类常见恶性肿瘤之一,全世界每年约30万人死于食管癌。我国是食管癌的高发地区,目前发病率居世界第一位。食管癌的发生是多因素作用、多基因变化和多阶段发展的过程,食管鳞状上皮癌变是经过从正常—非典型增生—癌的复杂过程,非典型增生是癌变发生的癌前阶段,所以对癌前病变的有效防治和对癌变的早期发现、早期诊断、早期治疗是降低食管癌发病率和死亡率的关键。随着调控细胞凋亡分子机制的深入研究,越来越多的研究表明,肿瘤是一类细胞凋亡紊乱疾病。细胞凋亡调控因子的异常表达将导致细胞凋亡紊乱,细胞增殖加速和死亡减少,最终生长失控。本研究运用多种实验技术,对细胞凋亡中彼此作用紧密的多个调控基因在食管上皮癌变过程中的表达进行检测,并分析食管上皮癌变过程中DNA倍体的变化,以期进一步阐明细胞凋亡多个调控基因Fas-Fasl-Fadd-c-FLIP-Caspase8-Caspase3在食管上皮癌变中的作用机制。化学药物的治疗已成为治疗恶性肿瘤的重要方法,但是绝大多数化学药物的细胞毒性缺乏特异性。斑蝥素,是从中药斑蝥中提取的一种抗肿瘤活性成分,但由于其毒性作用限制了临床应用,去甲斑蝥素系根据斑蝥素的化学结构,去1、2位甲基合成而得,不仅具有显著的抗癌作用,且毒副作用较小,同时具有升白、保护肝细胞、调节免疫功能等作用,临床上主要用于治疗肝癌、食管癌及胃癌等,去甲斑蝥素对食管癌细胞的作用机制研究在国内外尚未见报道。本研究通过体外培养食管癌Eca-109细胞,研究去甲斑蝥素作用后细胞形态、细胞凋亡及其调控基因表达的变化,探讨去甲斑蝥素在食管癌细胞中的作用机制,为食管癌的化学预防提供实验依据。方法:1免疫组化及原位杂交方法检测食管上皮各病变Fas、Fasl、Fadd、Caspase8基因的表达收集手术切除食管癌组织标本60例,非典型增生及正常组织各30例。所有标本经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规HE染色,进行病理组织学诊断。免疫组化SP法检测食管癌组织、非典型增生组织和正常食管上皮中Fas、Fasl、Fadd、Caspase8蛋白表达;原位杂交方法检测Fadd、Caspase8基因mRNA表达。并分析基因表达之间的相互关系以及与临床病理特征的关系。2 FCM定量检测食管上皮各病变DNA含量及细胞凋亡调控因子的表达收集食管癌手术切除石蜡标本癌组织30例,非典型增生组织20例和正常食管粘膜组织10例。运用流式细胞术,采用碘化丙啶一步插入性DNA荧光染色方法,检测样品的DNA含量,分析DNA倍体;采用间接免疫荧光标记方法定量检测细胞凋亡相关调控因子Fas-Fasl-Fadd- c-FLIP -Caspase8-Caspase3基因的表达,并分析各调控因子之间相关性。3去甲斑蝥素对Eca-109细胞凋亡及其调控基因作用的研究对食管鳞癌细胞株Eca-109进行常规培养,用不同浓度的去甲斑蝥素(0、5、10、20、40μg/ml)进行干预,分别作用6、12和24小时。应用MTT法测定其对细胞的生长抑制作用,HE染色后光镜观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞超微结构的变化,琼脂糖凝胶电泳进一步观察去甲斑蝥素对Eca-109细胞凋亡的诱导作用;采用流式细胞术分析去甲斑蝥素作用后细胞凋亡及增殖的变化,应用免疫细胞化学方法观察细胞凋亡调控因子Fas- c-FLIP -Caspase8-Caspase3蛋白表达的变化, western blot定量检测基因蛋白Fas、c-FLIP、Caspase8、Caspase3表达,采用半定量RT-PCR检测基因Caspase8、Caspase3mRNA的表达,并分析各基因表达之间的相关性及其在去甲斑蝥素抗食管癌中的作用机制。结果:1 Fas、Fasl、Fadd、Caspase8基因在食管上皮各病变的表达Fasl基因表达在从食管正常上皮、非典型增生到癌组织中皆呈逐渐升高的趋势,食管癌组织中Fasl蛋白表达阳性率(51/60,85%)明显高于正常上皮(18/30,60%)(P<0.01),癌组织和非典型增生组间的Fasl表达无显著差异;在癌组织中,高中分化癌阳性表达率(34/36,94%)显著高于低分化(P<0.05),非典型增生组内Fasl表达无显著差异。Fas基因表达在从食管正常上皮、非典型增生到癌组织皆呈逐渐降低的趋势,食管癌组织中Fas蛋白表达阳性率(41/60,68%)明显低于正常上皮(28/30,94%)(P<0.01),癌组织和非典型增生组间的Fas表达无显著差异;在癌组织中,高中分化癌阳性表达率(29/36,81%)显著高于低分化(P<0.05),非典型增生组内Fas表达无显著差异;从食管正常上皮—非典型增生—癌组织,Fadd蛋白和mRNA表达皆呈逐渐降低的趋势,食管癌组织中Fadd蛋白阳性表达率(38/60,64%)显著低于正常粘膜(28/30,96%)(P<0.01);mRNA阳性表达率(36/60,60%)明显低于正常粘膜组织(27/30,91%)(P<0.05),癌组织和非典型增生组间及癌组织与非典型增生各组内之间,Fadd蛋白、mRNA阳性表达率无显著性差异(P>0.01)。从食管正常上皮—非典型增生—癌组织,Caspase8蛋白和mRNA表达皆呈逐渐降低的趋势,食管癌组织中Caspase8蛋白高表达(43/60,71%)显著低于正常粘膜(29/30,98%)(P<0.01);mRNA阳性表达率(40/60,67%)明显低于正常粘膜组织(27/30,92%)(P<0.05),癌组织和非典型增生组间的Caspase8表达无显著差异,在癌组织中,高中分化癌蛋白阳性表达率(34/36,94%)显著高于低分化(P<0.05),mRNA阳性表达率(31/36,86%)显著高于低分化(P<0.05),非典型增生组内Caspase8蛋白、mRNA阳性表达率无显著差异。在食管上皮各病变中,Fas与Fasl基因蛋白表达之间呈显著性负相关关系(p<0.05),Fadd与Caspase8基因蛋白表达之间呈显著正相关关系(P<0.01),其余基因蛋白表达两两之间比较无显著性相关。Fas、Fasl、Fadd、Caspase8基因表达与食管癌及癌旁组织的组织分化程度有关,与年龄、性别、发病部位、肿瘤浸润深度、是否有淋巴结转移、淋巴结转移数目等临床病理参数无明显相关关系。2食管上皮各病变中DNA含量及细胞凋亡调控因子的表达从食管正常粘膜、非典型增生组织到癌组织,DNA含量逐渐增高,二倍体所占百分比明显降低,异倍体率明显增高。正常粘膜(1.00±0.04)和非典型增生组织(1.03±0.03)的DI值皆与癌组织(1.35±0.19)有显著性差异(P<0.01或P<0 .05)。10例正常组织和20例非典型增生组织均为二倍体(100%),30例食管癌组织中有例(84%)为异倍体。癌和癌旁组织异倍体率比较有极其显著性差异。Fasl、c-FLIP基因蛋白表达从正常上皮、非典型增生到癌组织中皆呈逐渐升高的趋势,Fasl、c-FLIP基因蛋白在食管癌中的表达皆显著高于癌旁组织,两者比较具有显著性差异(P<0.01); Fas、Fadd、Caspase8和Caspase3蛋白表达从正常上皮、非典型增生到癌组织中皆呈逐渐降低的趋势,在食管癌中的表达皆显著低于癌旁组织,两者比较具有显著性差异(P<0.01)。基因相关性比较发现,Fas与Fasl基因蛋白表达之间呈显著性负相关关系(p<0.05),Fadd与Caspase8基因蛋白表达之间呈显著正相关关系(P<0.01),但其它基因之间无明显相关关系(P>0.05)。3去甲斑蝥素对Eca-109细胞凋亡及其调控基因的影响去甲斑蝥素对Eca-109细胞有生长抑制作用,并呈时效和量效依赖关系。细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为10μg/ml。用10μg/ml去甲斑蝥素干预Eca-109细胞24小时后,在光镜下观察并与对照组比较,细胞数目明显减少,细胞由原来的多角形转变为长梭形,细胞轮廓变得清晰,核浆比例降低。电镜下观察,细胞核变小,皱缩,染色质边集,形成半月,核仁不明显;细胞质增多,线粒体和粗面内质网数量减少。提示Eca-109细胞趋于凋亡。流式细胞仪分析细胞凋亡,在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即“凋亡峰”,细胞凋亡率与去甲斑蝥素作用呈时间和剂量依赖关系。去甲斑蝥素作用24h的凋亡率为20.68±3.12%;去甲斑蝥素作用后,Eca-109细胞在细胞周期中的分布发生了明显的变化,随着作用时间延长和药物浓度的增加,G0/G1期细胞数逐渐增加,S和G2/M期细胞数逐渐减少,有时效和量效关系。DNA琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条带。10μg/ml去甲斑蝥素对Eca-109细胞分别作用6、12、24小时后进行免疫细胞化学检测。对照组中,Fas、Caspase8和Caspase3蛋白在细胞中呈弱阳性表达,10μg/ml去甲斑蝥素作用后,细胞中的蛋白表达水平明显升高。处理组细胞的c-FLIP蛋白表达水平比不加药对照组普遍降低。western blot定量检测基因蛋白表达,随着去甲斑蝥素作用时间的延长,Fas、Caspase8和Caspase3表达水平逐渐升高,c-FLIP表达水平逐渐降低,而且有明显的时效关系。半定量RT-PCR检测mRNA表达,去甲斑蝥素作用6小时后,Caspase8、Caspase3mRNA表达水平皆明显升高,去甲斑蝥素的作用和基因mRNA表达呈现明显的时效关系。结论:1 Fas和Fasl基因在食管上皮癌变过程中表达比例失调,且呈显著负相关关系,表明二者协同作用是食管上皮癌变机制中的重要事件,对二者的联合检测可能为食管癌的早期诊断提供新思路。2食管上皮各病变中,DNA含量随病变程度加重而逐渐增加。DNA异倍体率是反映食管癌恶性生物学特征的指标之一。3首次对形成死亡诱导信号复合体中的重要成员Fadd、Caspase8,在食管上皮癌变过程中进行了蛋白水平和核酸水平的分析,结果显示,Fadd和Caspase8基因蛋白和mRNA的表达均逐渐降低,提示两者均参与食管癌的发生、发展过程。4从食管正常上皮—非典型增生—癌组织的过程中,进行了Fas介导的凋亡信号传导通路上相关基因的研究,结果显示,Fas和Fasl基因表达比例失调,Fadd、Caspase8和Caspase3的蛋白表达逐渐降低,c-FLIP基因蛋白表达逐渐升高,均表明细胞凋亡的级联调控机制Fas-Fasl-Fadd-Caspase8-Caspase3-c-FLIP在食管上皮癌变过程中起着重要作用。5去甲斑蝥素对人食管癌Eca109细胞的生长有抑制作用,呈时间和剂量依赖性,其生长抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡相关。6本实验首次证实去甲斑蝥素诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的机制,可能是通过调节细胞膜死亡受体相关的Caspase信号传导途径来实现的,表现为上调Fas、Caspase8和Caspase3的表达,下调c-FLIP的表达。