HBXIP及KLK7作为子宫恶性肿瘤预后和治疗评估的分子标志物的研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ayun33
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一。近年在欧美等国家子宫内膜癌的发病率已跃居女性生殖系统肿瘤首位,在我国也逐年上升,部分地区子宫内膜癌的发病率甚至超过官颈癌,跃居女性生殖道恶性肿瘤首位。为提高子宫内膜癌患者的生活质量改善其预后,深入研究子宫内膜癌分子发病机制,重视子宫内膜癌的早期筛查、早期诊断、治疗评估是必要的。1983年Bokhman提出子宫内膜癌分子机制的二元论模型:I型子宫内膜癌(雌激素依赖型),Ⅱ型子宫内膜癌(非雌激素依赖型)[1],但是具体机制尚不明确。随着科学研究的不断深入,一些致癌蛋白不断被发现,它们在分子水平影响恶性肿瘤的机制不断被探讨。肝炎BX-相互作用蛋白Hepatitis B x-interacting protein(HBXIP)是许多肿瘤发生发展过程中重要的致癌蛋白之一。它的大小为19k Da,可与乙肝病毒X蛋白结合并与其羧基C末端相互作用[2]。1998年HBXIP基因首次被克隆。虽然高等动物的各种组织几乎都可以检测到HBXIP基因的表达,但HBXIP高表达于肌肉组织和恶性肿瘤组织中[3]。目前虽然对肝炎BX-相互作用蛋白生理功能了解尚不明确,但是随着深入研究恶性肿瘤发病机制,对HBXIP的关注将日益增多。肝炎BX-相互作用蛋白Hepatitis B x-interacting protein能够与杆状病毒IAP(凋亡蛋白抑制子)重复序列家族蛋白共存进一步调节细胞分裂,从而导致细胞凋亡[4]。现阶段研究表明:HBXIP可与人体内许多种蛋白结合,并参与细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期进程、中心体复制以及肿瘤细胞迁移等[5]。作为多功能的调节蛋白之一[6],肝炎BX-相互作用蛋白可能通过调节不同的转录因子从而影响其表达[7]。HBXIP也可能参与m TORC1等信号通路[8]。它在多种肿瘤细胞中高表达并可能通过多种途径促进肿瘤细胞的生长。研究表明:肝炎BX-相互作用蛋白能够诱导肝癌细胞Hep G2的PI3K/AKT信号通路活化,从而导致Cyclin D1表达增高。HBXIP的过表达可能促进肝癌细胞的血管生成,进而促进肿瘤的生长[9];HBXIP可通过一些分子机制促进乳腺癌细胞的生长:在乳腺癌组织中肝炎BX-相互作用蛋白与S100A4表达呈正相关,并且能够上调S100A4表达[10],HBXIP可上调PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)的基因表达及蛋白SW480水平或HT-29的水平促进肠癌细胞生长[11];它也能通过活化转录因子E2F1进而上调S期激酶相关蛋白2(Skp2)[7]。同时,HBXIP也能通过活化TFIID上调Lin28B、通过活化转录因子Sp1上调PDGFB[12]。此外,作为survivin抗凋亡的辅因子之一,HBXIP可抑制caspase-9前体活化[13]。在唾液腺恶性肿瘤细胞中也检测到HBXIP的表达,HBXIP基因沉默能够抑制腺样囊性癌ACC细胞株ACC-2的增殖、迁移和侵袭[14].最新研究[15]发现,HBXIP过表达与宫颈癌发病及病情进展有一定相关性,并有可能作为宫颈癌早期诊断的生物标记物之一,但是目前HBXIP在子宫内膜癌的表达和作用机制尚未见报道。恶性肿瘤的病程快速进展明显降低患者的生存率。早期诊断、早期治疗可改善癌症患者的预后,提高其生存质量。在鉴别癌前病变与癌、明确肿瘤病理分期,指导精准治疗评估预后过程中,不断发现的分子标记物提供了有力的支持。Fei[16]发现HBXIP可调节肺癌MCF-7细胞系对依托泊甙的敏感性,从而为人类肺癌治疗的靶点之一。而目前子宫内膜癌分子标记物的研究也不断深化,新的分子标记物不断被发现[17]。PIK3CA基因突变导致PI3K/AKT/m TOR通路的激活参与了子宫内膜癌发病及病情进展[18],Ki-67作为普遍存在于增殖细胞核中的标志性抗原之一,与子宫内膜癌的病理类型、分期、分级及淋巴结转移相关,是评价子宫内膜癌的重要标记物[19]。对于子宫内膜癌发病机制的分子水平相关因子深入研究,对基于子宫内膜癌分子发病机制研究的分子标记物[20]的深入探索,可有助于我们进一步探讨在子宫内膜癌发病的关键环节进行干预的可能性,因此,研究子宫内膜癌发生发展的分子机制并寻找评估其预后和治疗的分子标志物是目前子宫内膜癌研究的重要课题。宫颈癌是全球女性常见恶性肿瘤发病率第三位的癌症,在发展中国家与死亡相关的第二大癌症。目前,早期诊断筛查宫颈癌是有效的治疗手段,大大的改善了患者的临床预后,已被人们广泛应用,但仍需要进一步提高实验室的诊断方法和临床早期筛查手段从而提高诊断的准确性,使宫颈癌患者尽早得到及时有效的治疗。因此,对新的检测靶基因进行筛选和重要的个体化分子进行检测,已经越来越得到科研人员和临床医生的关注。人组织激肽释放酶(KLK1)和激肽释放酶相关肽酶(KLK2-15)是分泌型丝氨酸蛋白酶。激肽释放酶主要由上皮细胞分泌,参与许多生理过程,包括细胞外基质重塑的过程,皮肤脱落、激素原加工、神经可塑性,生长因子激活,生长代谢因子结合蛋白消化与电解质平衡。大量的证据表明激肽释放酶家族成员在不同肿瘤中的作用各异。此外,激肽释放酶家族成员的表达与卵巢、乳腺、胃、结直肠、胰腺、肝脏、口腔鳞状细胞癌和食道癌患者的临床病理参数相关。多项临床研究证实KLK家族成员在癌症中的表达的差异性,提示它们可能是潜在的肿瘤生物标记物。人组织激肽释放酶7(KLK7),也被称为人角质层胰凝乳蛋白酶,是首先在人体皮肤中提取到的蛋白。多项研究表明KLK7参与多种细胞外基质(ECM)的组成部分降解。目前KLK7在肿瘤中的作用尚不清楚。迄今为止,越来越多的证据表明KLK7转录和蛋白质在多种肿瘤中过度表达,包括乳腺,卵巢,宫颈癌。Talieri M等报道阳性表达KLK7的乳腺癌患者与阴性表达KLK7的肿瘤患者相对无病生存期较短(DFS)和总生存率(OS)缩短。Shan等学者通过单因素分析发现KLK7表达与卵巢癌的恶性程度相关。KLK7在宫颈癌表达明显高于正常宫颈腺体,提示KLK7可能是宫颈癌的诊断和治疗的重要标志物,参与宫颈癌的发病和恶性转化。主要研究结果如下:第一部分:HBXIP在子宫内膜腺癌中的生物学行为的研究目的:探讨HBXIP在子宫内膜腺癌(子宫内膜腺癌Ⅰ期,Ⅱ期,Ⅲ期)及子宫内膜组织样品(正常、不典型增生)中的基因和蛋白表达,与病理分级、肿瘤分期等临床特征之间的相关性。结合随访资料做生存分析,并分析HBXIP的表达和子宫内膜腺癌预后的关系。构建携带HBXIP基因的重组pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP质粒将其转染人子宫内膜癌HEC-1-A细胞,建立稳定表达HBXIP蛋白的细胞株,并检测HBXIP在人子宫内膜癌HEC-1-A细胞中的表达。探讨HBXIP基因调节子宫内膜癌细胞侵袭转移的机制。为HBXIP成为治疗靶点提供依据。方法:自中国医科大学附属第一医院及盛京病理教研室选取136子宫内膜腺癌病变蜡块,标本按照国际妇产科联盟FIGO(2009)子宫内膜腺癌的手术-病理分期,子宫内膜腺癌Ⅰ期56例,(ⅠA期32例,ⅠB 24例)子宫内膜腺癌Ⅱ期43例,子宫内膜腺癌Ⅲ期27例、IV期10例.无淋巴转移者118例,有淋巴转移者18例;肌层浸润深度<1/2 78例,≥1/2肌层浸润深度为58例;其中包括临床子宫内膜腺癌组织新鲜样品20例(样品采集后,在离体30分钟内,迅速置于-80℃液氮中冷冻,此后运输及储存均在液氮中)。采集样品的患者术前均未行放疗、化疗及相关激素治疗,病理学诊断复核所有标本。另取因子宫肌瘤(良性))而行手术而切除子宫的患者的新鲜子宫内膜样品30例,其中正常子宫内膜样品20例、不典型增生子宫内膜样品10例。采集样品分为两份,其中一份在离体30分钟内,迅速置于-80℃液氮中,此后运输及储存均置于液氮中,一份立即用石蜡包埋。免疫组化法检测组织样品中HBXIP表达;Western blotting方法检测新鲜组织样品中HBXIP表达。采用PCR逆转录c DNA扩增HBXIP基因全长,亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1-myc-his A内,构建出重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP,经酶切及DNA测序证实:重组质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP正确插入HBXIP的核苷酸序列。证实HBXIP基因成功插入空载体pc DNA3.1-myc-his A,脂质体法将pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染子宫内膜癌细胞HEC-1-A,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌细胞HEC-1-A中HBXIP蛋白表达。以转染pc DNA3.1-myc-his A空载体为对照,运用Transwell实验检测过表达HBXIP后子宫内膜癌细胞迁移及侵袭能力的变化。HBXIP基因沉默后子宫内膜癌细胞检测MMP9表达变化,结果:1.HBXIP在三种组织中均存在表达但表达部位及程度不同,在子宫内膜腺癌组织中HBXIP主要表达在细胞核,在正常子宫内膜及不典型增生子宫内膜组织中主要表达在细胞浆,HBXIP在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜、子宫内膜腺癌组织中高表达率分别为20%,60%,84%,3组之间的表达的差异具有统计学意义(P<0.05)。2.HBXIP的高表达强度的增强与子宫内膜腺癌患者的淋巴结转移有关,与子宫内膜腺癌患者的肌层浸润深度亦有关。HBXIP的高表达,有淋巴转移组明显高于无淋巴转移组,两组之间的差异有统计学意义(P<0.0 01);HBXIP的高表达也与肌层浸润深度相关。浸润深度≥1/2的患者组HBXIP的表达强度明显高于浸润深度<1/2患者组,两组之间的差异具有明显的统计学意义(P<0.0 01);HBXIP的高表达与发病年龄、妊娠次数没有表现出明显的相关性,(P>0.0 01),3.HBXIP的高表达与FIGO分期、组织学分级有关。FIGO分期与HBXIP高表达成正相关,III期+Iv期组与I期+II期组相比,两组之间HBXIP表达的差异有统计学意义(P<0.0 01);随着子宫内膜腺癌分化程度降低,HBXIP的高表达逐渐呈上升趋势,低分化组(G3)与高分化组(G1+G2)相比,HBXIP的高表达的差异有统计学意义(P<0.0 01)4.对生存数据行Kaplan-Meier分析比较:HBXIP高表达组的5年无进展生存率低于HBXIP低表达组,经Log-rank检验两组之间的差异有统计学意义(P<0.001)。5.单因素生存分析结果显示,手术分期、组织学分级、肌层浸润、淋巴转移、HBXIP高表达等指标对无瘤生存期(progression free survival,PFS)的影响有统计学意义(P<0.001);发病年龄对PFS影响没有统计学意义(P=0.693,0.187);手术分期、组织学分级、肌层浸润、淋巴转移、HBXIP高表达等指标对总生存率(overall survival,OS)的影响有统计学意义(P<0.001,)。手术-病理分期I、II期OS显著高于III期,G 1、G2 OS显著高于G3,无淋巴结转移组OS显著高于有淋巴结转移组,肌层浸润<1/2组OS显著高于≥1/2组.HBXIP高表达患者总生存率显著低于HBXIP低表达患者。6.多因素生存分析显示:手术分期和组织学分级对PFS的影响有统计学意义(P=0.004,0.003;),而淋巴结转移与PFS的关系更为密切。肌层浸润程度和HBXIP不同表达对OS的影响有统计学意义(P=0.001),其中肌层浸润程度与OS的关系较密切6.Western blotting结果:子宫内膜腺癌组织样品中HBXIP表达明显增高,结论:从正常增生期子宫内膜至不典型增生内膜至子宫内膜腺癌的进展过程中,HBXIP的表达强度逐渐增强,HBXIP高表达的增强可能与子宫内膜腺癌病情进展有关。HBXIP可能作为判断子宫内膜腺癌恶性程度以及预后的一个重要指标。7、HBXIP总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明获得的RNA和m RNA完整。PCR扩增后的产物在约276bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的c DNA片段长度一致。8、HBXIP基因真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP成功构建,重组质粒经pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的HBXIP基因片段。9、Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1-A细胞中HBXIP蛋白表达。pc DNA3.1-myc-his A组与pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP组HBXIP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。10.transwell迁移实验表明,过表达HBXIP后HEC-1-A细胞的迁移能力明显高于于对照组及未处理组;体外侵袭实验显示,过表达HBXIP后HEC-1-A细胞的侵袭能力明显高于于对照组及未处理组。11.用HBXIP的si RNA转染HEC-1A细胞系,Western blotting检测HBXIP和MMP9蛋白质表达水平,发现HBXIP基因沉默后,MMP9表达减弱,而过表达HBXIP,MMP9表达增强,表示HBXIP可能通过MMP9调节细胞迁移侵袭能力。结论:1.从增生期子宫内膜至不典型增生内膜至子宫内膜腺癌的进展过程中,HBXIP的表达强度逐渐增强,HBXIP表达的增强可能与子宫内膜腺癌病情进展有关,HBXIP可能作为判断子宫内膜腺癌恶性程度及预后的一个重要指标。2.HBXIP基因片段被成功插入真核表达载体质粒pc DNA3.1-myc-his A的多克隆位点,成功构建了HBXIP基因的重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP3.构建的HBXIP基因重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染子宫内膜癌细胞HEC-1-A后,在HEC-1-A细胞中稳定表达,从而为进一步研究HBXIP基因奠定了一定的基础。4..过表达HBXIP促进了子宫内膜癌细胞HEC-1-A侵袭转移。5..HBXIP基因沉默后,MMP9表达减弱,HBXIP能够调控MMP9表达,HBXIP可能通过MMP9促进癌细胞侵袭、转移。第二部分:血清kallikrein 7在宫颈癌中的表达的生物学意义目的:利用血清激肽释放酶7(KLK7)表达诊断宫颈癌及评估其预后。方法:收集78例宫颈癌患者,36例良性宫颈疾病与50例健康对照。血清采用ELISA法测定KLK7水平。ROC特性曲线进行评估血清KLK7的诊断性能。Kaplan-Meier对生存时间进行分析血清KLK7表达与病人总体生存时间关系。进行单变量和多变量Cox回归分析。评估宫颈癌总体生存的独立预后因素。结果:宫颈癌患者血清KLK7水平患者为3.13±1.99/ml,显著高于对照组宫颈良性病变患者的价值疾病(1.40±1.14/ml,P<0.001)和健康对照组(1.27±0.73/ml,P<0.001)。预测宫颈癌血清KLK7值敏感性,特异性,阳性和阴性分别为75.6、80.2,77.6和78.4%。宫颈癌患者血清KLK7表达水平与肿瘤分期,淋巴结转移,侵袭转移呈显著相关。生存曲线分析显示高血清KLK7水平与预后不良相关。结论:血清KLK7可能是一个有价值的宫颈癌诊断生物标记物,可能有助于确定患者的个体预后。
其他文献
<正>在西方教育思想发展史上,"园丁"被引入教育领域是近现代以来的事情。17世纪捷克教育家夸美纽斯提出著名的"种子说",即"学问、德行与虔信的种子是自然存在我们身上的"[1]
习近平全面从严治党思想是马克思主义政党特别是执政党管党治党规律的最新理论成果,是习近平新时代中国特色社会主义思想的重要组成部分。它实现了战略层面的巩固党长期执政
本文针对目前市场营销策划教学中存在的现实问题,基于提高学生对策划知识的把握和应用,以策划岗位素质要求为导向,从教学内容、教学方法、教学手段和教师实践四个方面提出了
以山西朔县出土2.8万年前最早的遗存到岩画、陶绘、壁画、帛画、砖画,再到西画东渐、中西合璧。浩繁画史中涌现出了不计其数的画家,
运用单元和多元GARCH族模型和动态条件相关模型(DCC),分析了P2P网贷利率与传统金融市场的波动溢出效应。分析发现,一是网贷利率具有尖峰厚尾、波动集聚的特征,但不具有杠杆效
目的探讨N-去硫酸肝素对SD大鼠种植性肝癌模型血管内皮生长因子(VEGF)表达、血管生成和肿瘤转移的影响。方法用Walker-256癌组织种植SD大鼠肝脏建立肝癌模型。种植3天后,30只
【正】下笔是否肯定、果断,是衡量一个人能否成为画家和大画家的重要标志之一。一切成功人士都善于思考,做任何一事之前,都在思考后作出判断,然后在做还是不做中做出肯定,这
背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界各种癌症死亡中,肺癌占据最高比例,肺癌的成功治疗有赖于对其早期诊断,而通常临床检出肺癌时已届晚期。现发现神经元胞质蛋白基因
文中提出一种适合山区拦河坝工程结构的新型活动式拦河闸,从而解决了汛期泄洪、排除泥砂、保障两岸农田无损、引水工程安全、降低工程造价的实际问题。并对活动式拦河闸的启
目的:CDl05,又名Endoglin,是表达于内皮细胞膜上的一种糖蛋白,其主要功能是参与血管形成,在有新生血管的组织中高表达。以往的研究证实,复发转移性乳腺癌患者血清CDl05的表达水平升