星形胶质细胞是脑内数量众多的一大类细胞群体，其在维持神经电活动正常环境、调节神经递质代谢、保护神经元及促神经再生和修复过程中发挥重要的作用。大量研究表明，星形胶质细胞功能障碍能够影响神经元的存活，与帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经退行性疾病的发生发展密切相关。PD是一类严重影响老年人身心健康和生活质量的神经退行性疾病。PD的主要病理学改变是DA能神经元的退行性病变。尽管已经提出线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性、遗传因素和炎症等病理机制参与DA能神经元死亡，但导致DA能神经元变性、死亡的确切病理机制目前仍不清楚。在PD患者和MPTP造模动物脑内黑质区均存在星形胶质细胞活化，活化的星形胶质细胞产生大量的活性氧和炎性因子，这些毒性物质促发神经元变性，促进了PD的发生发展。同时，PD等神经退行性疾病中星形胶质细胞的凋亡则进一步影响神经元的存活，参与PD的病理过程。星形胶质细胞在脑内氧自由基的清除过程中发挥着重要作用，而且，星形胶质细胞为神经元内谷胱甘肽的合成提供前体物质。因此PD病变中，星形胶质细胞抗氧化能力下降及其发生的氧化应激损伤，都会加剧病程的发展。包括本实验室在内的研究工作表明，保护星形胶质细胞、维持其正常功能是神经保护的重要新策略。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channels，K-ATP通道）是一类耦联细胞电活动和代谢、以细胞内ATP／ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。近年来，包括本实验室在内的研究表明：K-ATP通道特别是线粒体ATP敏感性钾通道（mitoK-ATP通道）与PD的发生、发展密切相关，是PD临床治疗学研究和研发治疗药物的新靶标。mitoK-ATP通道位于线粒体内膜上，其开放可调节线粒体基质体积，维持线粒体功能正常，进一步保护了整个细胞和机体组织。因此，能透过血脑屏障的K-ATP通道开放剂是富于治疗学潜力的神经保护剂。新型K-ATP通道开放剂埃他卡林（iptakalim，IPT）是我国学者设计、合成的脂肪仲胺类小分子化合物。IPT易透过血脑屏障、在不扩张血管和降低血压的剂量时即可产生确切的神经保护作用，使得应用整体动物模型评价K-ATP通道开放剂的神经保护作用成为可能。本实验室前期研究表明，IPT不仅对急慢性脑缺血损伤具有确切的神经保护作用，而且对应用多种神经毒素如6-羟基多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、鱼藤酮（Rotenone，Rot）等制备的PD整体动物模型和神经元损伤都具有保护作用。然而，IPT的神经保护作用是否与调节星形胶质细胞功能以及线粒体功能相关，目前仍不清楚。本文研究工作应用1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP⁺）制备PD模型，首先整体研究IPT对MPP⁺致PD模型大鼠的神经保护作用及其对脑内胶质细胞活化的影响；第二部分离体研究IPT对MPP⁺诱导的星形胶质细胞活化、凋亡和抗氧化能力下降的影响，探讨IPT对星形胶质细胞功能的调节作用及其机制；第三部分提取星形胶质细胞线粒体，研究IPT对MPP⁺诱导的星形胶质细胞线粒体功能障碍的保护作用及其机制。第一部分埃他卡林对MPP⁺制备的帕金森模型鼠的神经保护作用目的：研究、阐明IPT对MPP⁺制备的PD模型大鼠的神经保护作用。方法：大鼠单侧纹状体立体定位注射MPP⁺制备PD大鼠模型，手术后第7天开展滚轴实验观察大鼠运动协调功能；行为学实验后，灌注动物并取脑，免疫组织化学法检测黑质部TH、GFAP和ED1阳性细胞；酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定外周血中TNF-α的含量。结果：单侧纹状体立体定位注射MPP⁺诱发大鼠产生运动协调功能障碍；与伪手术组相比，模型组大鼠损毁侧黑质部DA能神经元显著缺失，其数量为伪手术组的45％；损毁侧黑质部星形胶质细胞和小胶质细胞显著活化。预先给予IPT(1.5 mg·kg^-1·day^-1，3.0mg·kg^-1·day^-1)或Diazoxide(3.0 mg·kg^-1·day^-1)显著改善MPP⁺导致的大鼠运动协调功能障碍，减少黑质部DA能神经元的缺失；IPT和Diazoxide能够抑制MPP⁺诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，并且抑制外周血TNF-α水平的升高。结论：预先给予IPT显著缓解MPP⁺诱导的大鼠运动协调功能障碍，促进黑质部DA能神经元存活。IPT发挥保护作用的机制与抑制MPP⁺诱导的神经胶质细胞活化、减少炎症因子的生成有关。第二部分埃他卡林改善MPP⁺导致的星形胶质细胞功能损伤目的：研究、阐明IPT对MPP⁺所致的星形胶质细胞凋亡、抗氧化能力下降以及活化的调节作用及其机制。方法：培养大鼠原代星形胶质细胞，Hoechst 33342荧光染色和流式细胞仪测定细胞的凋亡；JC-1荧光探针检测线粒体膜电位；Western-blotting法测定p38／MAPK、JNN／MAPK、AIF、细胞色素C和ERK／MAPK的表达变化；改良Tietze法测定谷胱甘肽含量；硝基苯胺生成法测定γGT活性；ELISA法测定TNF-α含量。结果：1)MPP⁺诱导星形胶质细胞线粒体膜电位降低以及随后致凋亡因子的释放，上调JNK／MAPK磷酸化水平，抑制ERK／MAPK的磷酸化，导致细胞凋亡；IPT和Diazoxide抑制MPP⁺的上述作用，从而抑制星形胶质细胞凋亡。mitoK-ATP通道阻断剂5-HD取消IPT和Diazoxide的抗凋亡作用。2)MPP⁺降低星形胶质细胞内GSH的水平，抑制γGT的活性；IPT或Diazoxide单独作用均增加星形胶质细胞内GSH的水平；IPT或Diazoxide还能够抑制MPP⁺降低GSH水平的作用，该效应被5-HD逆转；但IPT和Diazoxide对γGT的活性无显著影响。3)MPP⁺诱导星形胶质细胞活化释放TNF-α，上调p38／MAPK磷酸化水平；IPT（10μM）或Diazoxide（100μM）通过抑制MPP⁺诱导的p38／MAPK磷酸化，减少TNF-α的生成。IPT和Diazoxide的上述作用均被选择性mitoK-ATP通道阻滞剂5-HD（250μM）拮抗。结论：IPT抑制MPP⁺诱导的星形胶质细胞凋亡、抗氧化能力下降以及活化，改善了星形胶质细胞的功能。第三部分埃他卡林改善MPP⁺导致的星形胶质细胞线粒体功能障碍目的：研究、阐明IPT对MPP⁺所致的星形胶质细胞线粒体功能障碍的影响。方法：提取星形胶质细胞线粒体，给予药物干预，Western-blotting法测定线粒体内和释放的细胞色素C含量的变化；氧电极法测定星形胶质细胞线粒体呼吸功能；荧光素酶法检测线粒体ATP的含量；荧光酶标仪检测线粒体内ROS的含量；比色法检测复合物Ⅰ和Ⅳ的活性变化。结果：MPP⁺（50μM）与星形胶质细胞线粒体孵育30 min导致细胞色素C从线粒体内释放和ROS的生成增加、线粒体呼吸功能下降、ATP生成减少和线粒体复合物Ⅰ和Ⅳ的活性降低；IPT（10μM）或Diazoxide（10μM）改善MPP⁺诱导的线粒体呼吸功能障碍、增加ATP的生成、降低ROS的产生、抑制细胞色素C从星形胶质细胞线粒体内的释放，mitoK-ATP通道阻滞剂5-HD（50μM）部分拮抗该作用；IPT抑制MPP⁺诱导的线粒体复合物Ⅰ和Ⅳ活性的下降。Diazoxide只能抑制MPP⁺诱导的线粒体复合物Ⅰ活性的下降，对复合物Ⅳ的活性无显著影响。IPT和Diazoxide的上述作用均不能被5-HD拮抗。结论：IPT通过开放mitoK-ATP通道和调节线粒体复合物活性，改善MPP⁺诱导的星形胶质细胞线粒体功能障碍。综上所述，本文研究工作的主要创新之处在于：1．发现K-ATP通道参予调节星形胶质细胞的功能，为星形胶质细胞功能障碍相关的神经退行性疾病的治疗提供了有益的思路。2．发现IPT通过调节星形胶质细胞功能发挥神经保护作用，其机制在于抑制MPP⁺诱导的星形胶质细胞活化和致炎因子的释放、凋亡以及抗氧化能力的下降，为将IPT发展为治疗PD的神经保护剂积累了必要的学术与实验基础。3．发现IPT除了作用于mitoK-ATP通道外，还通过影响线粒体复合物的活性发挥保护作用，为进一步研究IPT的神经药理作用拓展了研究领域。