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目的:体外研究RNA干扰对人髓母细胞瘤D341细胞株C-myc基因的沉默,探讨SiRNA转染浓度、转染时间和目的基因表达之间的相关性;同时观察沉默C-myc基因后,在一定转染浓度、转染时间,RNA干扰对细胞周期和细胞凋亡的影响。方法:不同浓度C-myc SiRNA转染D341细胞,24小时后抽取总RNA和总蛋白质,分别以RT-PCR和Western-blot检测C-myc mRNA和C-myc蛋白的表达;同时在转染后的24、48小时之后流式细胞仪检测和凋亡的变化。另外以100nM的C-myc SiRNA转染D341细胞,12、24、48、72小时之后抽取总RNA和总蛋白质,RT-PCR检测C-myc mRNA表达,Western-blot方法检测C-myc蛋白的表达;同时细胞滴片,免疫细胞化学检测。结果:200nM、100nM、50nM、25nM浓度SiRNA转染的D341细胞,C-myc RNA表达均下降,与空白对照组和阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Western-blot检测C-myc蛋白表达量,随着转染浓度的增加,SiRNA对C-myc蛋白的沉默效应增加。随着转染时间的增加,在24小时,对C-myc在RNA水平沉默效应最明显,在蛋白水平则在48小时出现最高沉默效应。转染细胞SiRNA浓度在100nM时,24小时后流式细胞仪检测,G1期细胞分布在72%-78%,S期细胞分布在16%-23%,空白对照组S期细胞分布在32-36%,G1期细胞分布在53-56%,细胞凋亡不明显。免疫细胞化学染色,表明SiRNA对C-myc蛋白的抑制随着浓度的增加效应增加,在时间点上,48小时出现最高沉默效应。结论:1.实验所选择的转染片断,在RNA水平及蛋白水平均对C-myc基因实施了沉默,沉默效率较高,是有效的沉默片断。2.在25nM、50nM、100nM、200nM浓度范围内,随着SiRNA浓度的增加,在RNA及蛋白水平均显示,对目的基因的沉默越明显。低浓度SiRNA即可抑制目的基因的表达,SiRNA对目的基因的抑制与转染浓度成线性相关。3.在12、24、48、72小时内,对C-myc基因在RNA水平达到最大沉默效应是在转染24小时,而在蛋白水平,则在转染48小时后出现最高沉默效应。4. SiRNA抑制C-myc的表达使细胞阻滞在G1期,S期细胞减少,使细胞由G1期到S期的转化停滞。5.沉默C-myc基因后,D341细胞生长明显受抑制,但并不增加细胞凋亡。