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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病，主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病自从1987年在美国首次报导以来，现已遍及世界各主要养猪国家，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。由ORF5基因编码的GP5蛋白是PRRSV最主要的结构蛋白和免疫原性蛋白之一，并能诱发最强的中和抗体，是研制PRRS新型疫苗的良好靶蛋白，但以天然ORF5基因构建的多种新型疫苗均难以诱发较早和较高水平的抗体，特别是保护性的中和抗体。CD154分子是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因数超家族(TNRF)成员，其表达谱广泛，主要表达于CD4~+T细胞表面，也表达在其它T细胞，如CD8~+或CD45RO~+／CD45RA~+T细胞、Tc1／Tc2细胞或B细胞表面。CD154与CD40分子之间相互作用与T淋巴细胞和B淋巴细胞活化、增殖、抗体产生、生发中心形成有关，近年有研究表明，CD154与疫苗联合运用能显著增强疫苗免疫效果。本研究以PRRSV ORF5基因为靶基因，构建了与CD154基因融合表达和共表达的ORF5基因核酸疫苗，探讨了CD154基因对PRRSV ORF5核酸疫苗的免疫增强作用。具体研究内容如下：1、猪CD154基因的克隆及其在大肠杆菌及真核细胞中的表达利用RT-PCR方法从湖北白猪外周血单核细胞中分离克隆猪CD154基因的完整编码区，进一步PCR扩增获得缺失信号肽(1-22aa)和跨膜区(23-46aa)的基因片段tCD154，将其克隆至原核表达载体pQE-80L的6×His下游，获得原核表达质粒pQE-tCD154，转化大肠杆菌DH5α诱导表达出分子量约29kD的融合表达蛋白6×His-tCD154，Western-blot证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时，将完整CD154基因克隆至真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游，获得融合表达质粒pEGFP-C1-CD154，转染Hela细胞，荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白的表达主要定位于细胞膜，表明猪CD154是一种膜蛋白。2、猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达和融合表达DNA疫苗的构建及其免疫效果以PRRSV ORF5基因为目标基因，以pCI-neo为载体，构建两种不同的DNA疫苗：第一种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154，第二种为猪CD154基因与PRRSV ORF5基因融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5n60-tCD154，比较两种疫苗与单独表达ORF5基因的PRRSV DNA疫苗pCI-ORF5的免疫效果差别。间接免疫荧光证实两种质粒在体外培养的HeLa细胞中均可正确表达GP5蛋白，与抗PRRSV的高免猪血清具有特异性反应。小鼠免疫试验结果表明，与猪CD154共表达或融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154、pCI-ORF5n60-tCD154诱导的抗GP5蛋白ELISA抗体和淋巴细胞增殖反应均明显优于单独表达ORF5的DNA疫苗pCI-ORF5，而且以与CD154共表达的DNA疫苗pCI-ORF5-CD154效果最好，说明猪CD154基因对PRRSV ORF5 DNA疫苗具有免疫增强作用，CD154是一种极具应用前景的免疫增强分子。