气孔是植物与外界沟通的门户,也是研究植物细胞信号转导的特有模式系统。本实验室的前期研究鉴定到一个植物特异的微丝结合蛋白SCAB1(Stomatal Closure Related Actin Binding Protein1),该蛋白的缺失会导致拟南芥在ABA处理下气孔关闭过程变慢,并且SCAB1的C端(272-496氨基酸)存在着普遍认为可以结合磷酸肌醇的PH(Pleckstrin homology)结构域。有文献推测,磷酸肌醇对气孔保卫细胞运动的影响可能是借助调节微丝状态来实现的,但还没有相关证据。因此,本文开展了 SCAB1调控气孔运动的机制的研究。本文研究首先使用PIP(Phosphatidylinositol phosphate)条带实验证明SCAB1能特异地结合PI3P(Phosphatidylinositol 3-phosphate),且结合位置处在中央 α-螺旋区域(54-272 氨基酸),而非PH结构域。为了进一步确定PI3P的结合域,作者在中央α-螺旋区域找到了四个可能的PI3P结合基序(RXLR-dEER),并将其分别突变。PIP条带实验表明,SCAB1同PI3P的结合至少需要两个PI3P结合基序。由于SCAB1的中央α-螺旋区域内有微丝结合域,本文推测PI3P可能影响SCABI的微丝调节功能。亚细胞定位的观察结果表明SCAB1与PI3P共定位。体外生化实验显示,PI3P同SCAB1的结合虽然不影响SCAB1结合微丝并使微丝成束的能力,但是会降低SCAB1稳定微丝的能力。当SCAB 1不能结合PI3P时,细胞的微丝对微丝解聚剂LatA(Latrunculin A)不敏感。使用 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase)抑制剂 WM(Wortmannin)降低拟南芥体内的 PI3P 含量时,微丝抵抗Lat A的能力增强。这些实验结果说明PI3P能够调控SCAB1稳定微丝的能力。气孔表型分析结果证明,SCAB1能够回补scab1突变体的气孔运动变慢的表型,不能结合PI3P的SCAB1蛋白突变体不能回补scab1突变体的表型,表明PI3P与SCAB1的相互作用参与了气孔运动的调节。已知PI3P在囊泡运输过程中发挥重要功能并参与液泡融合过程。本文分析了气孔关闭过程中PI3P、SCAB1、液泡之间的关系。结果发现,在气孔关闭过程中,大液泡皱缩为小液泡的位置处总能观察到微丝先解聚后聚合的现象,且PI3P沿SCAB1丝状结构运动。通过分析气孔关闭过程中保卫细胞内液泡状态,作者发现抑制SCAB1与PI3P的结合会减慢大液泡的皱缩过程。以上结果证明,SCAB1与PI3P的结合影响了微丝状态以及液泡的正常形变过程。综上,本文揭示了 SCAB1受PI3P调控,影响微丝稳定性以及液泡动态,进而调控气孔运动的新机制。此外,由文献可知IP3/IP6参与钙信号途径,而且本实验室与其他实验室的合作研究表明SCAB1可以结合IP3/IP6。为了了解SCAB1是否参与钙信号途径,本文通过检测气孔运动中的钙信号发现,外界刺激后scab1的钙信号高于野生型,而过量表达SCAB1的材料中钙信号水平低于野生型。在scab1背景下表达突变了IP3/IP6结合域的SCAB1,突变体的钙信号表型和气孔表型都不能被回补。说明SCAB1借助PH结构域结合IP3/IP6参与钙信号以及气孔运动途径。通过测定K+电流可知scab1保卫细胞内的钾离子外流受抑制。以上结果暗示,SCAB1调节气孔运动的方式之一可能是通过结合Ip3/IP6影响游离的IP3/IP6浓度,进而影响钙信号,K+通道的活性随之受到影响,内/外向钾电流发生变化最终影响了气孔运动。综上所述,本文的研究结果揭示了两条SCAB1参与的调控气孔运动的途径:首先,SCAB1可以通过结合PI3P调控液泡膜变形运动;其次,SCAB1可以结合IP3/IP6影响钙信号,参与对气孔运动的调控。研究结果对阐明气孔运动的机制有重要的科学理论意义。