金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中,可分泌多种毒力因子以及表面黏附蛋白,能引起菌血症、肺炎、心内膜炎、化脓性关节炎、中耳炎、深部脓肿等严重感染。金黄色葡萄球菌具有较强的存活能力和免疫逃逸能力,常导致慢性迁延性感染。其免疫逃逸机制,一方面与细菌本身的毒力因子,如毒素、酶和表面黏附因子等因素有关;另一方面可能通过与宿主细胞的相互作用,消减或抑制宿主免疫防御功能。近年来,随着万古霉素广泛应用于临床,异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌(hVISA)菌株不断出现。针对hVISA的研究显示,不但抗菌药物难以发挥作用,机体免疫系统也难以将其清除。hVISA在宿主体内免疫逃逸的分子机制尚不清楚,因此,深入探讨hVISA与宿主免疫系统之间的相互作用,将有助于我们理解金黄色葡萄球菌逃避宿主免疫反应并实现持续性感染的分子机制,为寻找新的治疗靶点提供理论依据。巨噬细胞是人体固有免疫系统重要的组成部分,具有强大的识别、吞噬、清除细菌及外来异物的功能。自噬是广泛存在于真核细胞中的一种机体生存,分化,发育,代谢所必须的自稳机制,作为天然免疫中重要的组成部分,同时也作为机体自我保护的生理学行为,在抵抗病原微生物感染以及其导致的炎症中发挥关键作用。但有些病原体已经进化出能抵抗或者逃避自噬清除的机制。有研究显示,金黄色葡萄球菌可以诱导宿主细胞产生亲细菌自噬,这种自噬将有助于金黄色葡萄球菌在宿主细胞内存活。本课题组此前一直关注金黄色葡萄球菌万古霉素耐药相关二元调控系统VraSR在金黄色葡萄球菌内的调控作用,发现它不但可以调控金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药,还可以与全局调控子Agr启动子区域直接结合,表明VraSR有较广泛的调控功能。进一步研究还发现,VraSR可以促进金黄色葡萄球菌粘附于上皮细胞,并增强其抵抗人中性粒细胞的吞噬及杀菌,协助hVISA逃避人体免疫系统的攻击。然而,VraSR参与调控金黄色葡萄球菌毒力的效应和其在免疫逃逸机制方面中发挥的作用尚不清楚。本研究将从细菌、动物和细胞三个方面来研究VraSR在hVISA的致病性调控网络中的作用以及其通过调控巨噬细胞自噬促进其免疫逃逸的分子机制。目的:本研究以hVISA标准菌株(Mu3)及其vraSR基因敲除株(Mu3ΔvraSR)和回补株(Mu3ΔvraSR-C)为研究对象,通过转录组学、动物实验和胞内生存实验深入探讨VraSR在金黄色葡萄球菌中的调控网络及其与金黄色葡萄球菌致病性的关系,并从细胞水平研究VraSR参与调控巨噬细胞自噬促进金黄色葡萄球菌免疫逃逸的分子机制,其结果将为寻找金黄色葡萄球菌感染诊疗新方法奠定理论基础。方法:(1)获取rVraR纯化蛋白和兔源VraR多克隆抗体,并利用qRT-PCR和Western blot鉴定本室保存的hVISA原代菌株(Mu3)、vraSR基因敲除株(Mu3ΔvraSR)及其回补株(Mu3ΔvraSR-C)的VraSR表达水平,确认菌株构建成功;(2)选择Mu3株和Mu3ΔvraSR株提取RNA,采用RNA-seq技术并结合生物信息学分析,筛选出Mu3株和Mu3ΔvraSR株中差异表达基因用qRT-PCR验证,揭示VraSR在金黄色葡萄球菌中的调控网络和致病性的关系;(3)将Mu3、Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C分别以皮下接种方式感染BALB/c小鼠,建立小鼠皮肤脓肿模型,观察VraSR对小鼠皮肤脓肿面积的影响;通过计算小鼠皮下脓肿内细菌CFU,观察VraSR对金黄色葡萄球菌在皮肤内生存的影响;通过小鼠皮肤脓肿组织H&E染色,观察皮肤组织炎症病理变化;(4)将Mu3、Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C分别以尾部静脉注射方式感染BALB/c小鼠,建立小鼠败血症模型,通过计算小鼠肝脏和肾脏细菌CFU,观察VraSR对金黄色葡萄球菌在体内生存的影响;通过小鼠肝脏和肾脏HE染色,观察肝脏和肾脏炎症病理变化;(5)将Mu3、Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C分别感染小鼠巨噬细胞系RAW 264.7建立体外感染模型,收集感染后0h、3h、6h、12h和24h的RAW 264.7细胞,利用平板菌落计数法计算不同感染组胞内细菌菌落形成单位(CFU);(6)将Mu3、Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C分别感染RAW 264.7细胞后,用透射电子显微镜观察金黄色葡萄球菌感染RAW 264.7后细胞的超微结构,比较不同感染组细胞内自噬体样囊泡的形成情况;分别于0h、1.5h、3h、4.5h和6h收集三株金黄色葡萄球菌感染后的细胞,用qRT-PCR检测自噬过程三个关键基因Ulk1、Becn1和Atg5的mRNA转录水平;收集感染后3h细胞,利用Western blot技术检测LC3的转化水平和P62的降解水平;用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染RAW 264.7细胞,金黄色葡萄球菌与该细胞共作用3h后,在激光共聚焦显微镜下观察金黄色葡萄球菌感染后细胞内LC3的点状聚集;利用不同阶段的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴弗洛霉素(Baf A1)预处理,比较不同菌株的生长速率,排除其对金黄色葡萄球菌生长速率的影响;利用Western blot技术比较不同感染组LC3的转化水平和P62的降解水平以及不同菌株在细胞内的生存率;(7)为了研究VraSR参与调控巨噬细胞自噬的具体分子机制,我们用Western blot检测了AKT/mTOR/P70S6K和p38信号通路,并用p38抑制剂(SB203580)进行验证。结果:(1)通过qRT-PCR和Western blotting技术对Mu3,Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C菌株中vraSR基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平进行检测,发现在Mu3ΔvraSR株中vraSR基因缺失表达,Mu3ΔvraSR-C菌株回复了vraSR基因表达,证实Mu3ΔvraSR和Mu3ΔvraSR-C菌株VraSR基因敲除和回补成功。(2)转录组分析结果显示,与金黄色葡萄球菌Mu3菌株相比,在Mu3ΔvraSR菌株中共有1210个基因发生改变,其中421个基因表达显著下调,789个基因的表达显著上调;与二元调控系统相关的基因有14个,与毒力相关的基因有23个发生显著性变化;经过GO聚类分析,发现VraSR的调控主要富集在细胞过程、定植、代谢等过程;KEGG通路分析显示,VraSR调控的基因主要在代谢途径、氨基酸生物合成和ABC转运等途径等通路中富集。利用qRT-PCR验证显示,检测基因的变化趋势和转录组测序结果一致,证实基因转录组测序结果可信;与Mu3株相比,Mu3ΔvraSR株中saeR、clfA、hla、hlb、tst、essA、dltb、efb、sodA和sbi基因下调,而agrA、sdrE、coa和spa基因上调,说明VraSR调控金黄色葡萄球菌的致病性,导致Mu3ΔvraSR的毒力多效性改变。(3)小鼠皮肤脓肿实验结果显示:与Mu3株相比,Mu3ΔvraSR株形成的脓肿面积减小,脓肿内Mu3ΔvraSR株细菌存活数量减低,白细胞浸润、炎症反应和组织结构破坏也较轻;回补VraSR基因后,回补株Mu3ΔvraSR-C导致小鼠皮肤脓肿面积、菌落计数及组织炎症反应与Mu3株引起的感染相似,表明VraSR有助于金黄色葡萄球菌在小鼠皮肤内形成脓肿,并有助于其在小鼠皮肤内存活。(4)小鼠败血症模型结果显示,与Mu3株相比,Mu3ΔvraSR株在肝脏和肾脏的菌落计数明显减低,白细胞浸润及组织坏死程度也较轻;回补VraSR基因后,回补株Mu3ΔvraSR-C株菌落计数得以显著回复,病理特征也和Mu3株引起的感染相似,表明VraSR有助于金黄色葡萄球菌在小鼠肝脏和肾脏形成脓肿,并有助于其在小鼠体内生存和繁殖。(5)细胞内生存实验结果显示:与野生型菌株Mu3相比,Mu3ΔvraSR菌株在RAW 264.7细胞中存活较少,且在整个感染过程中Mu3ΔvraSR菌株的存活率持续下降。当VraSR回补后,Mu3ΔvraSR-C株在RAW 264.7细胞中的存活率与Mu3相似,表明VraSR有助于金黄色葡萄球菌抵抗巨噬细胞清除,并有利于其在巨噬细胞内存活和增殖。(6)透射电子电镜结果显示,Mu3?vraSR株感染组仅观察到少量的自噬体样囊泡(8±1.5/50 cells)(P<0.01),而Mu3株(27±2.5/50 cells)和Mu3?vraSR-C株(23±1.5/50 cells)有较多的自噬体样囊泡,表明VraSR有助于金黄色葡萄球菌感染巨噬细胞后自噬体样囊泡的形成;qRT-PCR检测结果发现,与Mu3株感染细胞相比,Mu3?vraSR株感染的细胞在3 h时的Becn1和Atg5转录水平显著降低(P<0.01),而回补VraSR后,Mu3?vraSR-C感染的细胞的Becn1和Atg5转录水平回复到Mu3株水平,说明VraSR有助于金黄色葡萄球菌感染巨噬细胞后自噬基因的表达;Western blot分析结果显示,Mu3?vraSR感染细胞中的LC3-II和p62表达水平明显低于Mu3和Mu3?vraSR-C感染组(P<0.01),表明VraSR参与金黄色葡萄球菌感染RAW 264.7细胞自噬流的调控;激光共聚焦结果显示,与Mu3感染组比较,Mu3?vraSR感染组在3h时具有较少的LC3黄色点状聚集(P<0.01),而Mu3?vraSR-C感染组与Mu3感染组相似,有较多的黄色点状聚集,再次表明VraSR促进了金黄色葡萄球菌感染细胞内自噬体的形成;Mu3?vraSR感染组比其他两组具有更多的单红LC3点状聚集(P<0.01),表明VraSR可以阻断或延迟RAW 264.7细胞内自噬体与溶酶体的融合;自噬抑制剂处理后结果显示,3-MA可降低RAW 264.7细胞的LC3-II表达水平,并显著降低了Mu3和Mu3ΔvraSR-C菌株胞内存活率(P<0.01);Baf A1处理组显著增加了所有感染组的p62蛋白表达水平,Mu3ΔvraSR感染组细菌存活率显著增加。以上结果表明,VraSR可通过抑制巨噬细胞自噬流以提高金黄色葡萄球菌胞内存活率。(7)Western blot检测结果显示,三株细菌感染细胞的AKT、mTOR和P70S6K蛋白表达水平及磷酸化水平变化无显著性差异,但Mu3?vraSR感染组p38蛋白磷酸化表达水平变化显著降低,回补VraSR后,回复株Mu3?vraSR-C感染组可以回复p38磷酸化表达水平。当加入p38磷酸化水平抑制剂后,Mu3感染组和Mu3?vraSR-C感染组p62蛋白表达水平显著下降,细菌在细胞内的生存率显著降低,与Mu3?vraSR感染组的p62表达水平类似。以上结果表明,VraSR可以通过激活p38磷酸化来抑制自噬体的成熟,阻止自噬体与溶酶体融合,而不受AKT/mTOR/p70S6K信号通路调控。结论:(1)金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR调控hVISA菌株的致病性,导致hVISA菌株的毒力多效性改变。(2)金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR有助于hVISA菌株在动物体内和巨噬细胞内生存。(3)金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR有助于hVISA菌株诱导巨噬细胞自噬促进细菌在细胞内生存。(4)hVISA菌株通过VraSR高表达来激活p38磷酸化,抑制自噬体的成熟,阻止自噬体与溶酶体融合,而不依赖于AKT/mTOR/p70S6K途径。