前列腺癌(prostate cancer)是男性生殖泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,发生在前列腺上皮的恶性肿瘤,主要包括腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、尿路上皮癌等几种病理类型。据2012年的数据统计,该年在世界范围内有1,111,700例新增病例,使前列腺癌成为男性第二位常见的肿瘤。在1,111,700例病例中,发达国家的新增病例为758,700例,发展中国家的新增病例为353,000例。其中,欧洲、大洋洲、北美洲等地区的发达国家前列腺癌的发病率是世界平均水平的25倍以上。前列腺癌的发病率除了在不同地区之间存在明显差异,在不同种族之间也存在明显差异。它在黑人中的发病率最高,白人的发病率次之,亚洲男性的发病率最低。虽然前列腺癌在南亚和东亚的发病率则低于欧美国家,但情况也不容乐观。与发达国家相比,亚洲、东欧等地区的发展中国家的前列腺癌发病率也在逐年上升。在日本和中国,前列腺增生的发病率已经接近西方国家。前列腺癌在死亡率方面也不容乐观。2012年全世界共有307,500人死于前列腺癌,占肿瘤总死亡率的3.75%,是男性肿瘤相关死亡因素的第五位。其中,发达国家的死亡人数为142,000,发展中国家的死亡人数为165,500。尽管发展中国家的发病率远低于发达国家,但发展中国家与发达国家与的总死亡人数差异不大,这与发展中国家人口基数大有关,也与发展中国家的前列腺癌患者的死亡率明显高于发达国家有关。前列腺癌常用Gleason评分系统为其评分分级,其中2分为最低,10分为最高。临床上根据评分不同,对前列腺癌患者进行分期,进而采用不同的治疗手段。如:手术切除、放射性治疗、药物化疗、激素治疗、聚焦超声治疗等。前列腺癌患者在经历一段时间的激素治疗后,往往发展成激素难治疗性前列腺癌(Hormone refractory prostate cancer,HRPC),病情进一步恶化,造成患者生活质量下降,临床结局差。如果在前列腺癌早期进行有效干预,将能有效改变患者的生活质量甚至延长生存期。流行病学研究显示,亚洲前列腺癌的低发病率可能与其豆类食物的高消费有关。大量研究表明,豆类食物中所含的大豆异黄酮等物质具有抗肿瘤的作用。大豆甙元(daidzein)是大豆异黄酮的一种,主要存在于大豆及其制品之中。大豆甙元被肠道中的糖苷水解酶水解之后,进一步被肠道菌群代谢成次级代谢产物-雌马酚(equol)。与其他的异黄酮相比,equol在呋喃环c-3的位置有一个手性碳原子。因此,equol存在s型与r型两种旋光异构体,然而至今在人体中只发现了s型雌马酚(s-equol)。并不是所有的人都具备将大豆甙元代谢成equol的能力,这种代谢能力与不同个体的肠道菌群不同有关。它在不同国家、不同地区人群中是有差异的,我们将具有这种能力的人称为“雌马酚代谢者(equol代谢者)”。在人群中,equol代谢者大约有30%-50%,其中西方国家的equol代谢者只有30%,远低于亚洲国家,如在日本的equol代谢者为58%,在中国的雌马酚代谢者为60.4%。equol作为一种植物类雌激素,能与雌激素受体(estrogenreceptors,er)结合。其中(±)equol及s-equol与er-β的结合能力强于与er-α,而r-equol刚好相反,与er-α具有更强的亲和力。有研究提示,与其他黄酮类植物化合物相比,equol具有更强的抗氧化性。equol除了具有抗氧化能力以外,在抗肿瘤方面也有一定作用。在体外实验中证明,equol可以通过抑制mmp2,mmp9mrna的表达抑制前列腺癌的转移。在乳腺癌细胞中,equol可以通过上调caspase8的活性,激活外源性凋亡通路,又可以通过促进cytochromec的表达,激活下游caspase,引起细胞内源性凋亡。叉头转录因子o3(forkheadboxo3,foxo3a)基因编码的蛋白也称为foxo3或foxo3a。foxo3a作为转录因子,在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。近来,shukla等报道foxo3a在抑制前列腺癌的发生发展过程中起着重要作用。foxo3a主要是通过上调细胞周期蛋白p21、p27和凋亡相关蛋白fasl、bim的转录来抑制前列腺癌的生长。同时,foxo3a又可以被蛋白激酶akt、erk、ikk等负调控。它们通过磷酸化foxo3a的t32、s253和s315三个位点后,促使foxo3a由细胞核转移到细胞质中,然后被e3泛素化酶mdm2降解。蛋白激酶b(pkb)是丝氨酸和苏氨酸的特异性激酶,又被称作akt。它在细胞中的糖代谢、凋亡、增殖、迁移等过程都扮演着重要的角色。akt通过与膜上磷脂酰肌醇三磷酸(pi3k)以正确的方式结合以后,可以被pdpk1和mtorc2分别磷酸化thr308和ser473位点,激活akt的活性,使其能调控下游蛋白磷酸化的表达,进而发挥其功能。有研究显示,akt可以磷酸化foxo3a,从而调节foxo3a的转录活性。本研究通过体外实验,研究s-equol是否直接影响前列腺癌细胞的生长,以及其效应是否与akt/foxo3a通路有关。同时,在裸鼠移植瘤模型中研究了s-equol对前列腺癌的作用,为s-equol进一步作为治疗或者辅助治疗前列腺癌的候选药物奠定基础。实验方法:1.采用mtt法,观察s-equol对前列腺癌细胞pc3,du145,lncap,及正常前列腺上皮细胞rwpe-1生长的抑制作用;2.采用流式细胞仪,观察s-equol对前列腺癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响;3.采用免疫荧光细胞化学法,观察s-equol对前列腺癌pc3细胞中foxo3a蛋白核定位的影响;4.采用蛋白免疫印迹法,观察s-equol对前列腺癌pc3细胞中总akt、p-akt以及总foxo3a、p-foxo3a蛋白表达的影响。同时观察foxo3a下游相关分子p21,p27,bim,fasl蛋白表达的变化;5.采用pi3k/akt抑制剂wortmannin抑制p-akt蛋白的表达后,观察s-equol对前列腺癌pc3细胞周期、凋亡、foxo3a蛋白核定位以及相关蛋白的影响;6.采用裸鼠移植瘤模型,观察s-equol在体内实验中对前列腺癌生长的作用。实验结果:1.s-equol能抑制前列腺癌细胞生长,对前列腺癌细胞lncap,du145和pc3的半数致死浓度(ic50)分别为:169.13μm、139.50μm和119.20μm。在相同浓度下,并不影响正常的正常前列腺上皮细胞rwpe-1的生长。2.200μms-equol能诱导前列腺癌细胞发生凋亡,其细胞凋亡百分比和凋亡指数分别为,lncap细胞:36.55±15.34%和188.4±21.2;du145细胞:10.77±0.14%和154.96±5.63,pc3细胞:14.31±0.64%和329.7±12.5。3.50-150μms-equol阻滞前列腺癌细胞周期,将lncap和du145细胞阻滞在g0/g1期,将pc3细胞阻滞在g2期。4.100μms-equol下调前列腺癌lncap,du145和pc3细胞中mdm2蛋白的表达,上调du145和pc3细胞中foxo3a蛋白的表达,对lncap细胞的foxo3a蛋白表达上调不明显。5.100μms-equol能抑制foxo3a蛋白核转出,使更多的foxo3a蛋白聚集在细胞核内。6.s-equol对pc细胞中foxo3a蛋白的上调和p-foxo3at32的下调具有剂量依赖,同时上调foxo3a相关下游p21,p27,bim,fasl蛋白的表达;s-equol下调p-aktser473和p-aktthr308蛋白的表达,同时对akt总蛋白的表达影响不大。7.Akt抑制剂-Wortmannin抑制p-Akt蛋白表达后,S-equol能进一步上调FOXO3a及其相关下游p21,p27,Bim,Fasl蛋白的表达,并抑制FOXO3aT32蛋白的表达。8.Wortmannin抑制p-AKT蛋白表达后,S-equol能诱导更多的细胞凋亡:Wortmannin组,100μM S-equol和Wortmannin+100μM S-equol组的凋亡指数分别为:108.4%、140.1%和389.9%。阻滞更多的PC3细胞在G2期:DMSO组:4.18±0.59%;Wortmannin组:4.95±1.11%;100μM S-equol组:22.82±0.32%;Wortmannin+100μM S-equol组:26.16±0.50。Wortmannin联合S-equol处理,使更多的FOXO3a蛋白聚集在细胞核内。9.S-equol在裸鼠移植瘤模型的中能抑制PC3细胞移植瘤的生长,10 mg/kg S-equol组的肿瘤比Control组的肿瘤缩小43.77%;同时,对裸鼠的体重并没有明显影响,毒副作用小。结论:1.在体外实验中,S-equol能通过Akt/FOXO3a通路诱导前列腺癌细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞生长;2.在体内实验中,S-equol能抑制前列腺癌抑制瘤的生长。