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生猪运输是猪肉生产过程中不可缺少的组成部分。育肥猪在运输过程中会出现失重增加、肉品质和胴体性状下降、疾病易感性增强和死亡率升高的现象,降低了动物福利,并增加了消费者和养殖者的成本负担。止痢草油作为一种具有抗氧化、抗菌和抗炎活性的植物提取物,在本课题组前期的研究中显示,能通过保护运输应激中育肥猪肠道的氧化损伤,起到缓解运输应激的作用。但是止痢草油对应激条件下猪肠道氧化损伤的调控机理尚不清楚。本研究从止痢草油缓解肠道氧化损伤的角度出发,首先通过上皮细胞、巨噬细胞以及上皮细胞和巨噬细胞共培养三个氧化应激模型研究了止痢草油缓解肠道氧化损伤的途径,并分别从抗氧化酶和氧化酶两个方面,探讨止痢草油缓解肠道上皮氧化损伤的分子机制。随后验证止痢草油缓解育肥猪运输应激的作用是通过控制肠道氧化损伤来发挥效果的。第一部分核转录相关因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor-2,Nrf2)通过和抗氧化效应元件(antioxidant response element,ARE)结合,上调ARE相关抗氧化基因(包括细胞内源性抗氧化蛋白和抗氧化酶),是细胞内调控抗氧化应答的关键转录因子。止痢草油被报道具有提高猪肠道抗氧化酶的作用,但作用机制尚不清楚。本试验,通过猪空肠上皮(IPEC-J2)细胞,探讨止痢草油提高上皮细胞抗氧化蛋白表达的具体分子作用机制。主要结果如下,止痢草油(2.5-10μg/ml)能够缓解过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)造成的IPEC-J2细胞氧化损伤,降低细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和脂质自氧化代谢物(malondialdehyde,MDA)的水平。止痢草油能剂量性增加铜/锌超氧化物歧化酶(cu/zn-superoxide dismutase,SOD1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(g-glutamyl cysteine ligase catalytic,GCLC)和谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(g-glutamyl cysteine ligase modifier,GLCM)的基因和蛋白水平,同时增加IPEC-J2细胞内SOD1和GSH的有效浓度。止痢草油能剂量性增加包含Nrf2的报告基因活性,提高细胞内Nrf2蛋白和基因水平,同时促进Nrf2由细胞质向细胞核的迁移。当IPEC-J2细胞Nrf2受到Nrf2 siRNA抑制时,止痢草油提高体内抗氧化酶表达的能力受到明显抑制,同时止痢草油抑制H2O2诱导的IPEC-J2氧化损伤能力也受到减弱。第二部分小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)活化对大鼠回肠上皮细胞(IEC-18)氧化损伤的影响。构建IEC-18细胞和RAW264.7细胞共培养体系,通过LPS诱导上皮细胞-巨噬细胞共培养模型,研究菌群紊乱导致肠道氧化损伤的作用途径,并探讨巨噬细胞活化在上皮细胞氧化损伤中的作用。结果显示:在LPS(10μg/ml)刺激下,RAW264.7降低IEC-18细胞跨上皮电阻值,提高IEC-18细胞荧光黄透过率,同时降低IEC-18细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在基因和蛋白中的表达,并破坏了IEC-18细胞紧密连接蛋白的结构。RAW264.7细胞能增加IEC-18细胞中ROS和MDA水平,降低谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/striatal oxidized glutathione,GSH/GSSG)比值。RAW264.7细胞能增加IEC-18细胞凋亡蛋白的表达,碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色流式细胞术分析和原位荧光检测进一步验证了细胞凋亡的结果。NOX2是NADPH氧化酶的催化亚基,转染NOX2 siRNA,RAW264.7细胞增加共培养体系中活性氧的水平和降低IEC-18细胞屏障功能的能力受到抑制。第三部分止痢草油对NADPH氧化酶介导的氧化应激和炎症反应的影响。止痢草油可以缓解菌群紊乱诱导的肠道的氧化损伤,但具体作用机制尚不清楚。本试验以RAW264.7细胞为模型,研究止痢草油对LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激的影响,探讨止痢草油抑制RAW264.7细胞氧化应激的可能途径。止痢草油(2.5-10μg/ml)能够缓解过LPS(10μg/ml)造成的RAW264.7细胞氧化损伤,降低细胞内ROS和MDA的水平,提高GSH/GSSG的比值。止痢草油能降低LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB(p65)在RAW264.7细胞核内的富集,减少RAW264.7细胞炎性因子的分泌,同时抑制炎性因子基因的表达。转染NOX2 siRNA,当RAW264.7细胞NOX2受到抑制时,LPS促进RAW264.7细胞ROS产生和炎症因子mRNA表达的作用受到抑制。止痢草油能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NADPH氧化酶的激活,降低NOX2基因和蛋白表达水平。第四部分止痢草油缓解育肥猪运输应激和改善肠道的效果。同时评估止痢草油对育肥后期猪生长性能的作用。本试验试验选择255头商品猪,分为3组,即对照组、维生素E组(200 mg/kg)和止痢草油组(25 mg/kg)。饲养试验结束后,每组选择36头体重接近的育肥猪做5小时运输应激处理。结果显示:在运输应激条件下,维生素E对肠道没有保护作用,而止痢草油能提高育肥猪肠道绒毛高度,维持肠道绒毛的完整,同时止痢草油增加肠道紧密连接蛋白闭锁小带蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)和封闭蛋白(Occludin)的基因和蛋白表达,并降低血清中内毒素的水平。止痢草油对育肥猪空肠、回肠和结肠中总菌落、粪肠球菌属和乳酸杆菌属的数量没有影响。但是止痢草油能降低空肠、回肠和结肠中大肠杆菌的数量。止痢草油能降低育肥猪空肠中氧化应激标志物ROS和MDA的水平,同时提高抗氧化酶T-SOD的水平。在运输应激状态下,和对照组相比,止痢草油组能降低育肥猪运输失重率,并提高育肥猪胴体重和屠宰率。与对照组相比,不同抗氧化剂组均能提高背最长肌45 min pH和24 h色值。止痢草油组与对照组相比,能显著降低滴水损失,而维生素E组对滴水损失没有影响。不同抗氧化剂组和对照组相比,均能降低育肥猪体内ROS和MDA的水平,而和维生素E组相比,止痢草油组抗氧化效果更好。与对照组相比,止痢草油组具有提高谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,Gpx)和总超氧化物歧化酶活性(total superoxide dismutase,T-SOD)的作用,但是维生素E组对提高抗氧化酶活性没有影响。此外,同对照相组比,止痢草油组提高猪育肥后期平均日增重,同时止痢草油组具有降低降低料肉比的作用。本研究主要结论:(1)止痢草油能提高肠道上皮细胞抗氧化能力,其机制包括两个方面:第一,2.5-10μg/ml止痢草油通过激活IPEC-J2细胞转录因子Nrf2,提高了细胞内抗氧化酶SOD1和GSH的表达。第二,巨噬细胞活化产生的活性氧是诱导上皮细胞氧化损伤的重要原因。在LPS诱导RAW264.7细胞产生氧化应激的模型中,2.5-10μg/ml止痢草油抑制了NADPH氧化酶的表达,降低活性氧的产生。(2)宰前28天育肥猪日粮中添加25 mg/kg止痢草油,能提高育肥猪生长性能,同时改善育肥猪运输应激过程中的失重和肉质降低,与止痢草油平衡肠道菌群,抑制肠道自由基的过度产生,同时提高抗氧化酶活性,从而保护肠道免受氧化损伤有关