研究背景： 本课题在DOCA/盐大鼠高血压模型上探讨EPCs数目及功能的变化。目前的研究提示氧自由基对EPCs的存活和功能有着重要影响。更有研究在氧自由基增高的体外和体内模型中发现端粒酶的活性影响了EPCs的存活。因此本课题检测了DOCA/盐高血压大鼠EPCs氧自由基水平、凋亡百分率和端粒酶活性，以揭示在DOCA/盐高血压中EPCs功能异常的分子机制。此外，我们实验室以往的研究已经证实了DOCA/盐高血压大鼠呈现明显增强的氧化应激，ET-1可以通过ETA/NADPH氧化酶途径增加血管壁上氧自由基的形成。在此基础上，在本课题中我们在体内和体外使用了ETA受体的特异型拮抗剂和NADPH氧化酶的抑制剂来探讨ETA受体和NADPH氧化酶在DOCA/盐高血压EPCs功能异常中的作用。 第一部分EPCs在DOCA/盐大鼠中的水平及ET-1对EPC数量的影响 目的： 观察DOCA/盐大鼠体内EPCs的水平变化及DOCN/盐高血压中的主要效应激素ET-1对正常EPCs数目的影响。 方法： 通过鼠尾袖带动脉测压法(tail—cuff method)检测DOCA/盐大鼠及假手术大鼠的动脉收缩压，用Dil-acLDL/lectin双染法和流式细胞术评价EPC的水平，以探讨EPC在DOCN盐高血压大鼠中的数目变化及ET-1对内皮祖细胞存活的影响。用免疫组化方法和Real time PCR的方法分别检测EPCs上ETA和ETB受体蛋白和mRNA的表达。 结果： 1、DOCA/盐处理4周后，DOCA/盐大鼠的血压显著升高，与同时期的Sham组相比有显著性差异。DOCA/盐大鼠经ETA受体特异性拮抗剂ABT—627或NADPH氧化酶的抑制剂Apocynin治疗四周后，其血压较DOCA/盐高血压大鼠有了明显的改善。 2、DOCA/盐高血压大鼠的EPC数量较Sham组明显降低。而在ABT—627或Apocynin治疗的DOCA/盐大鼠组里，EPC的数量较Sham组没有明显的改变。流式细胞术的结果也显示在Sham组中CD34+细胞和Flk-1+细胞的比例分别为24.9±1.9％和15.6±2.2％。而DOCA/盐高血压大鼠中CD34+细胞和Flk-1+细胞的比例分别降到了14.5±3.8％和9.7±3.5％。 3、ET-1体外刺激正常大鼠EPCs达48小时后，EPCs数量明显降低为了进一步验证Ac—LDL/lectin双染的结果，我们用流式细胞术检测了CD34+和Flk-1+细胞的比例。流式的结果显示ET-1处理48小时后，CD34+细胞比例从31.5±3.2％降到18.27±4.8％；Flk-1+细胞比例从21.1±1.9％下降到16.3±0.7％。同样的，在体外实验中，我们也证实了ABT—627或Apocynin都可以在体外逆转ET-1所诱导的EPCs数目的降低。而ETB受体特异拮抗剂BQ788不能阻止ET-1所诱导的EPCs数量的降低。此外，EPCs在转染了编码功能负突变的Racl的腺病毒载体(adenoviral vector encoding dominant—negative Racl，DNRacl)后，也逆转了ET-1所诱导的EPCs数目的降低(9.5±0.4 vs.10.1±0.3细胞/高倍视野(400×)，p>0.05 vs．control组)，而EPCs在转染了β—gal后，没有看到相同的效应。 4、ETA和ETB受体的mRNA和蛋白均在外周血EPCs上表达。 第二部分DOCA/盐大鼠EPCs中ROS水平及ET-1对EPCs中ROS的影响 研究目的 观察DOCA/盐大鼠EPCs的ROS水平及ET-1对正常大鼠EPCs细胞内ROS的影响。 研究方法： 通过Dichlorofluroescein(DCF)荧光显微镜技术测量EPCs细胞内ROS的水平，以探讨DOCA/盐大鼠EPCs中ROS的变化以及ET-1对正常EPCs中ROS的影响。 结果： 1、DOCA/盐高血压大鼠中EPCs的DCF荧光强度较Sham组的EPCs的荧光强度要大约1.5倍(152±8.8％ vs.100±2.2％，*p＜0.05)。而DOCA/盐大鼠经ETA受体特异性拮抗剂ABT—627或NADPH氧化酶的抑制剂Apocynin治疗四周后，其EPCs的DCF荧光强度较Sham组没有明显增强(107.6±8.8％，108.9±6.7％ vs.100±2.2％，p＞0.05)。 2、我们发现在外源性的氧自由基产生物质LY83583刺激18小时后，来自DOCA/盐高血压大鼠的EPCs的DCF荧光强度较弃基础值有了明显的升高(239±20.6％ vs.152±8.8％，＃p＜0.05)。而来自Sham组，ABT—627治疗组和Apocynin治疗组的EPCs对LY83583的反应较基础值没有明显改变。 3、ET-1培养48小时后，EPCs的ROS水平较对照组明显升高了将近2倍(197.8±10.6％ vs.100.0±4.3％，*p＜0.05)。而在ABT—627或Apocynin预处理后，EPCs的ROS水平维持在对照组的水平上(101.2±4.2％和108.7±4.2％ vs.100.0±4.3％，p＞0.05)。 第三部分DOCA/盐大鼠EPCs的端粒酶活性和凋亡的变化及ET-1对EPCs端粒酶活性和凋亡的影响 研究目的： 探讨DOCA/盐大鼠EPCs的端粒酶活性和凋亡的变化及ET-1对EPCs端粒酶活性和凋亡的影响。 研究方法： 通过端粒重复扩增—酶联免疫法检测EPCs的端粒酶，通过TUNEL检测EPCs凋亡百分率，以探讨DOCA/盐大鼠EPCs端粒酶活性和凋亡的情况以及ET-1对EPCs端粒酶活性和凋亡的影响。 结果： 1、DOCA/盐高血压大鼠的EPC端粒酶的活性与Sham组比较明显降低了(154.5±33.7％ vs.456.1±42.5％，*p<0.05)；体内用ABT—627或Apocynin治疗后，端粒酶保持了原来的活性(367.4±30.2％，374.0±49.6％ vs.154.5±33.7％，p>0.05)。 2、DOCA/盐高血压大鼠的EPCs的凋亡比例较Sham组明显增高(148.3±4.2％ vs.100.0±7.4％，*p<0.05)．DOCN盐大鼠经ETA受体特异性拮抗剂ABT—627或NADPH氧化酶的抑制剂Apocynin治疗四周后，其EPCs发生凋亡的比例与Sham组比较没有变化(104.7±14.7％和110.0±8.1％ vs.100.0±7.4％，p>0.05)。 3、用LY83583分别处理来源于DOCA/盐高血压组，Sham组，DOCA/盐+ABT—627治疗组和DOCA/盐+Apocynin治疗组的EPCs18小时后，检测细胞凋亡的发生。如Fig所示，DOCA/盐高血压组的TUNEL阳性细胞的比例较基础值明显增多(206.7±14.0％ vs.148.3±4.2％，＃p<0.05)；而其它三组的TUNEL阳性细胞比例础值比较没有明显变化。 4、ET-1培养48小时后，EPC的端粒酶的活性较对照组明显降低了约4倍(135.4±31.5％ vs.513.6±56.6％，*p<0.05)。而在ABT—627或Apocynin预处理后，EPC端粒酶的活性维持在对照组的水平上(507.1±116.9％，490.6±118.8％ vs.135.4±31.5％，p>0.05)。 5、ET-1培养48小时后，EPC的TUNEL阳性细胞比例较对照组明显升高了约1.6倍(166.8±7.6％ vs.100.0±5.6％，*p<0.05)。而在ABT—627或Apocynin预处理后，EPC中TUNEL阳性细胞维持存对照组的水平上(107.4±8.6％和102.8±6.6％ vs.100.0±5.6％，p>0.05)。 小结： 1、经4周的DOCA/盐处理后，DOCA/盐大鼠的血压显著升高，但DOCA/盐高血压大鼠的EPCs的水平明显降低。 2、DOCN/盐高血压大鼠EPCs的氧自由基的水平明显升高，同时伴有凋亡百分率的增高和EPC端粒酶活性的降低。 3、DOCA/盐高血压大鼠EPCs抗氧自由基的能力及DOCA/盐高血压大鼠EPCs抗氧自由基诱导的凋亡的能力明显受损。 4、ETA和ETB受体的mRNA和蛋白均在外周血EPCs上表达。 5、ET-1可以在体外减少正常EPC的数量；明显增加正常EPC细胞内的氧自由基水平；ET-1在体外显著抑制EPC端粒酶的活性并促进正常EPC发生细胞凋亡： 6、ETA受体特异性拮抗剂或NADPH氧化酶抑制剂可以逆转上述EPC体内或体外效应。 结论： 目前的研究提示，DOCA/盐高血压EPC的水平显著降低，并伴有EPCs细胞内氧自由基水平升高、凋亡百分率增高和端粒酶活性降低。其机制可能与ET-1部分激活ETA/NADPH氧化酶有关。