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背景和目的:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种分泌自身抗体、形成大量免疫复合物、以终末器官损伤和慢性炎症为主要特征的系统性自身免疫性疾病。近年来,世界各地SLE发病率呈上升趋势,且多好发于15～40岁生育期女性。SLE临床上主要采用激素治疗,副作用大。随着医学科技的发展,出现了一种新的治疗方法—干细胞疗法。干细胞是一类非常与众不同的细胞群体,在医学界被称为“万用细胞”。许多研究证实干细胞可以治疗多种疾病。目前,采用异基因间充质干细胞移植治疗难治性、重症SLE患者取得了较好的疗效。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)属于间充质干细胞的一种,具有间充质干细胞的特性,具有免疫调节的能力和分化为多种细胞的能力。与其他间充质干细胞相比,ADSCs具有来源丰富、应用安全、价格便宜、伦理限制少等优点。现己有研究报道ADSCs对系统性红斑狼疮造成的免疫系统损害有一定的调节作用。巴戟天(Morinda officinalis How,M0H)具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效,为“补肾阳之要药”。有研究表明补肾中药可以促进间充质干细胞的增殖治疗狼疮肾炎。故本研究通过探索ADSCs联合巴戟天提取物对B6.MRL-Faslpr/Nju狼疮小鼠的治疗,探索补肾中药巴戟天提取物是否能够促进ADSCs的增殖治疗B6.MRL-Faslpr/Nju狼疮小鼠的肾损伤,以及对SLE相关的免疫炎性因子是否产生影响,并探索巴戟天提取物的新用途和新机制。方法:一、脂肪间充质干细胞的分离、培养取10只成年C57BL/6J小鼠腹股沟、腹部、腋窝处脂肪组织,用PBS清洗干净后加入0.25%1型胶原酶,在37℃水浴震荡仪上消化40min;消化结束后离心,吸弃中层上清液,获得乳糜状的脂肪组织和脂肪间充质干细胞;将乳糜状的脂肪组织和脂肪间充质干细胞放入培养箱中共同培养,当细胞融合达到80～90%时进行传代。二、脂肪间充质干细胞的诱导分化及鉴定将第3代对数生长期的ADSCs细胞,接种于12孔板,进行爬片,细胞融合达到50～60%时,ADSCs免疫荧光鉴定表面标志物CD29、CD34、CD105、CD45的表达情况;将第3代对数生长期的ADSCs细胞,接种于6孔板,细胞融合达到100%时,加入成脂诱导液进行成脂诱导分化,成脂诱导结束后进行油红“0”染色;将第3代对数生长期的ADSCs细胞,接种于6孔板,细胞融合达到60%时,加入成骨诱导液进行成骨诱导分化,诱导结束后进行茜素红染色。三、ADSCs的生长周期及巴戟天提取物对ADSCs活性影响ADSCs接种于96孔板中,共设7组,每组5个复孔,CCK-8每天检测一组,共检测7天。根据吸光度计算出细胞的生存率,绘制ADSCs生长曲线;ADSCs接种于96孔板中,24h后用含有不同浓度巴戟天培养液处理细胞48 h,并设置正常对照组,每组5个复孔,用CCK-8检测细胞生存率。四、ADSCs联合巴戟天提取物对狼疮小鼠肾损伤及免疫炎性因子的影响将 10 只 C57BL/6J 小鼠设为正常对照组,40 只 B6.MRL-Faslpr/Nju(B6.MRL/lpr)小鼠随机分为模型组、脂肪间充质干细胞组(ADSCs组)、巴戟天治疗组(MOH组)、脂肪间充质干细胞联合巴戟天治疗组(ADSCs+MOH组)。正常组和模型组灌生理盐水;ADSCs组尾静脉注射脂肪间充质干细胞;MOH组灌胃巴戟天提取物10mg.kgH;ADSCs+MOH组联合治疗,共治疗8周。记录小鼠的体重及一般情况;ELISA法检测血清中抗dsDNA抗体浓度变化,肾组组织匀浆液中检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素17(IL-17)、白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)的表达水平,考马斯亮蓝法检测尿蛋白的浓度变化;HE染色观察肾脏病理结构的变化。结果:一、10只成年C57BL/6J小鼠分离获得10皿原代小鼠脂肪间充质干细胞,原代细胞开始培养时,细胞短小,呈圆形、卵圆形,三角形;24h后可见培养皿有少量细胞贴壁,48h后贴壁细胞数量大大增多,脂肪组织周围爬出细胞,细胞成旋锅状和成束状。第4～5天时细胞融合可达到80%～90%,细胞密集排列成束状交织或成旋锅状,细胞形态呈长梭形。小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈典型的“S”型,细胞增殖过程经历了潜伏期、生长期和平台期,第3～4天细胞增殖速度最快为快速生长期,第6～7天进入平台期。由此表明脂肪间充质干细胞生物特性稳定,活力强,更新速度快,易于进行体外扩增培养。二、ADSCs免疫荧光鉴定结果显示:CD45、CD34表达为阴性,CD29表达呈强阳性,CD105表达呈弱阳性。成脂诱导液诱导至第14天时,进行油红“0”染色,检测发现细胞浆中可见许多大小不等被染成红色的脂滴,说明ADSCs成功诱导为成脂细胞。成骨诱导至第21天时,显微镜下观察可见细胞结构严重变形,成立体结构,有渣滓样的钙结节,茜素红染色检测发现钙结节染成红色,表明ADSCs成功诱导为成骨细胞。三、CCK-8检测结果显示:巴戟天提取物浓度在20～200ug.mL-1范围可提高脂肪间充质干细胞(ADSCs)的生存率(P<0.05);浓度达到500ug.mL-1时ADSCs生存率明显下降(P<0.05)。由此说明巴戟天在一定浓度范围可以促进ADSCs增殖,提高细胞活性。四、小鼠一般情况观察结果:模型组毛发掉落严重,精神状态差,有2只小鼠死亡;ADSCs组小鼠毛发和精神状态改善,无小鼠死亡;MOH组、ADSCs+MOH组狼疮小鼠体重明显增加(P<0.05),毛发光泽,精神状态良好,无小鼠死亡。在实验指标方面,与正常组比,模型组抗dsDNA抗体、尿蛋白、TNF-α、IL-17、IL-10、IL-6明显升高(P<0.05;P<0.01);与模型组比,ADSCs组:抗dsDNA抗体、尿蛋白、TNF-α、IL-17、IL-6均下降(P<0.05;P<0.01),IL-10差异无统计学意义(P>0.05)。MOH 组:抗 dsDNA 抗体、尿蛋白、IL-17、IL-10、IL-6 均下降(P<0.05;P<0.01),TNF-α差异无统计学意义(P>0.05)。ADSCs+MOH组:抗dsDNA抗体、尿蛋白、TNF-α、IL-17、IL-10、IL-6均下降(P<0.05;P<0.01)。肾脏病理检查显示脂肪间充质干细胞、巴戟天及联合治疗都能够改善B6.MRL/lpr小鼠的肾脏病理结构,使肾小球细胞增生情况改善,体积变小,而脂肪间充质干细胞联合巴戟天治疗作用更明显。结论:本实验分离培养的小鼠脂肪间充质干细胞细胞形态稳定,细胞活性好,增殖能力强,可以分化为脂肪细胞和成骨细胞;免疫荧光鉴定脂肪间充质干细胞表型CD29表达呈强阳性,CD105表达呈弱阳性,CD45、CD34表达均为阴性,。巴戟天提取物可以促进脂肪间充质干细胞的增殖;脂肪间充质干细胞、巴戟天提取物及联合治疗均可改善B6.MR L/lpr小鼠肾脏病理结构,并对肾组织中部分免疫炎性因子有一定的调节作用,且联合治疗作用较单独治疗好,由此表明脂肪间充质干细胞、巴戟天提取物联合治疗对B6.MRL-Faslpr/Nju小鼠产生了协同的治疗效果;补肾中药巴戟天提取物可以促进ADSCs增殖改善B6.MRL/lpr狼疮小鼠的肾损伤,并对相关免疫炎性因子产生调节作用;巴戟天提取物对狼疮小鼠有一定的治疗作用,可以降低狼疮小鼠的抗dsDNA抗体、尿蛋白、IL-17、IL-10、IL-6,增加狼疮小鼠的体重。