草鱼是我国特有的具有巨大经济价值的鲤科大型鱼类，产量产值均位居我国淡水养殖鱼类第一。同时，草鱼也是能高效转化植物成为优质动物蛋白的鱼种，被誉为“水中牛羊”，研究草鱼肠道消化代谢功能基因相关特性将使我们从分子生物学水平上更客观、更精确地了解草鱼的营养消化机理和特性，本文采用雌性草鱼肠道为实验材料，采用非均一化的Oligo-dT引物定向克隆技术构建了草鱼肠道组织的cDNA文库，结合目前广泛应用于基因功能和表达模式的分析研究的EST测序分析技术，对具有时空性和组织特异性表达等功能基因特征进行了聚类分析，并且同GenBank等数据库进行比对、查询和注释。结果显示418条序列有相关同源性，其他的521(55.5％)条序列没有明显的同源性(E-value≥1.00E-10)，揭示出在这些ESTs中能够发现新功能基因的相当可能性。利用TRIzol法抽提草鱼肠道组织总RNA，经过亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)法从总RNA中分离纯化富含Poly(A)的mRNA，反转录合成ds cDNA，连接EcoR I接头，末端磷酸化，Xho I消化，将双末端黏性化的双链ds cDNA经过胶回收cDNA片段筛选收集大于500 bp的cDNA片段，加工后与pBluescript II SK(+)Vector连接，经电转化入DH10B宿主菌，构建cDNA文库，挑取阳性克隆，做PCR检测，然后根据电泳图粗略鉴定插入片断的大小及小片段率：将合格的cDNA文库送检。检测文库库容量至少为2.3×10~5，重组率达95％，平均插入片断长度大于1000 bp。大规模EST测序主要包括模板制备、测序反应、序列识别等流程。模板制备采用半自动化流水线方式，主要步骤包括：文库铺板培养，大量随机挑取菌落(cDNA克隆)，细菌增殖，质粒DNA提取，电泳鉴定等。测序及序列初步分析工作主要在北京华大基因研究中心完成。结果共进行了1571个成功反应，其中1411条ESTs长度大于100bp，使用Cross-match软件去掉EST中的低质量序列、载体序列、重复序列等，使用Phrap序列拼接软件将测序得到的EST拼接成重叠群，初步拼接得到939个单基因簇(Unigene)，其中包括188个重叠群(Contigs)，751个单拷贝EST(Singletons)。将拼接得到的重叠群和单拷贝EST与GenBank非冗余蛋白库比对并使用GO(Gene Ontology)分类的方法做功能注释。GO分类是现在较常用的EST分类方法，除此之外，还进行GC含量、密码子使用频率等分析。418个重叠群和单拷贝的ESTs中有195个可归属于细胞组分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物学过程(Biological processs)三个大类，而其余223个重叠群和单拷贝EST则为未知功能的EST。绝大部分EST与营养代谢、生理学过程、细胞结构、酶活性及细胞过程有关，少数与转录调节活性、信号传导活性以及细胞分裂分化等功能有关。本研究结果对草鱼以及其他鲤科鱼类的消化系统功能基因的筛选和发现具有指导意义。此外，草鱼肠道cDNA文库的构建和EST测序工作将为草鱼基因组计划的实施奠定基础。