论文部分内容阅读
MicroRNAs(miRNAs)是一类长约21-24个核苷酸(nt)的内源性非编码RNA。作为一类保守的转录后调控分子,它们在生物细胞基因表达调控的过程中发挥重要作用。杜氏盐藻是一类缺乏刚性细胞壁的光合嗜盐藻类,能适应多种极端环境,尤其是高光和高盐。当杜氏盐藻在该环境中生存时,细胞内以脂质球的形式积累大量β-胡萝卜素,起重要的保护作用。为探明miRNA是否参与调控杜氏盐藻胞内β-胡萝卜素的积累,本研究利用高通量测序技术分析了高光高盐胁迫处理前后杜氏盐藻(Dunaliella salina)CCAP19/18小RNA表达谱,鉴定出一系列差异的miRNAs,并预测其靶基因。其中miRNA novel-m0533-3p可能通过抑制其靶基因的方式促进类胡萝卜素合成。具体研究结果如下:1.通过透射电子显微镜观察杜氏盐藻细胞,结果显示处理组中β-胡萝卜素脂质球数量为对照组的4倍,说明高光高盐胁迫处理后,杜氏盐藻β-胡萝卜素含量显著上升。进一步高效液相色谱检测表明,在高光高盐胁迫处理下,杜氏盐藻胞内β-胡萝卜素含量从44.90 mg/g增加到305.63 mg/g微藻细胞干重;2.利用高通量测序技术分析处理前后的杜氏盐藻小RNA表达谱,分别获得了11,542,169和16,877,598条clean tags。结果显示杜氏盐藻小RNA长度主要分布在21 nt,并且其首位核苷酸明显偏好尿嘧啶(U);3.通过对杜氏盐藻小RNA表达谱分析,本研究发现了84个已知miRNAs(known miRNAs)和1054个未知miRNAs(novel miRNAs)。其中,9个known miRNAs和39个novel miRNAs的表达水平在高光高盐胁迫处理后发生显著改变(其中32个差异miRNAs表达上调,16个差异miRNAs表达下调)。MiRNAs靶基因的预测、注释和富集表明,杜氏盐藻miRNA可能存在多个预测靶基因,差异表达miRNAs的靶基因与生物和分子功能过程有关。其中,参与结合过程的靶基因最多,其次是催化活性过程、细胞过程和代谢过程;4.利用qRT-PCR对24个随机挑选的miRNAs进行验证,结果显示17个miRNAs在对照组和处理组中可被成功检测,其中5个miRNAs在处理组中表达水平显著上调。特别是novel-m0857-5p和novel-m0533-3p,在处理组中表达水平分别上调7.47倍和3.83倍。与此对应的是,novel-m0783-5p的四个预测靶基因表达水平分别下调71.72%、57.01%、53.14%和42.93%,novel-m0533-3p的预测靶基因表达水平下调68.88%;5.利用Western blot技术检测了novel-m0533-3p的靶基因苹果酸脱氢酶的蛋白表达水平,发现苹果酸脱氢酶蛋白表达水平下降。结合qRT-PCR结果,间接说明miRNA novel-m0533-3p对靶基因起到剪切作用;6.利用qRT-PCR分析了类胡萝卜素代谢通路关键基因的表达水平,发现在处理组中,PSY、PDS和LCYB表达水平均上调。尤其是PSY,与对照组相比提高了17倍,说明类胡萝卜素代谢途径显著加强;综上,杜氏盐藻在高光高盐胁迫下积累β-胡萝卜素且存在miRNA参与β-胡萝卜素的代谢途径。本研究初步阐释了miRNA参与杜氏盐藻β-胡萝卜素积累的分子调控机制,为探索利用基因调控手段提高杜氏盐藻β-胡萝卜素的含量提供新的思路。