目的：　　以弓形虫Prugniaud株实验感染ICR小鼠，从多个方面动态观察该弱毒株所致小鼠隐性弓形虫病的病程特点，包括转归和预后，以及各重要器官和组织的病理学改变，其中着重观察和研究病变脑组织中几种细胞因子水平的变化及其与脑部病理变化的关系。然后，用环磷酰胺诱导该隐性弓形虫病小鼠转化为急性弓形虫病，并观察在诱导复发过程中三唑类抗真菌药物-氟康唑和伊曲康唑对小鼠可能的保护作用。　　方法:　　1、弓形虫Prugniaud株包囊的获取：无菌手术取感染弓形虫Prugniaud株1个月以上小鼠脑组织，在加有1 ml PBS的匀浆器中充分研磨，然后用小鼠淋巴细胞分离液处理后获取脑组织包囊，计数备用。　　2、实验动物感染：244只ICR雌性小鼠随机分为弓形虫感染组183只和正常对照组61只，分为三批次进行试验。感染组小鼠每只腹腔内注射弓形虫Prugniaud株包囊10个（PBS稀释为0.5ml），对照组注射同等量的PBS。感染后每天观察小鼠表现，包括发病症状、死亡、恢复等情况，直至180天。　　3、于感染后第5、10、15、20、25、30、60、90、120、150和180天分别随机取出感染组小鼠5只和对照组小鼠3只，先用眼球摘除法取全血（ACD抗凝），低温保存备作提取DNA用；接着处死小鼠并解剖，肉眼观察病变后摘取肝、脾、肺、肾、心和脑组织，一部分以中性福尔马林固定作组织病理学切片，另一部分用 PBS冲净血液低温保存备作提取 DNA用。对感染小鼠脑组织，在用 PBS冲净血液后，一半冻存于-80℃冰箱，另一半放于样品稳定剂中，于-20℃冰箱保存。以备作脑组织细胞因子检测用。　　4、提取上述不同时间的小鼠全血和内脏组织的DNA，用 PCR仪检测弓形虫 B1基因特异性片段。　　5、对上述不同时间获取的组织进行病理切片，HE染色，普通光学显微镜下观察并摄影；同时制作组织切片进行免疫组织化学染色，普通光学显微镜下观察弓形虫抗原抗体复合物并摄影。　　6、实时荧光定量PCR检测脑组织中细胞因子：提取保存于样品稳定剂中脑组织的总 RNA，反转录为 cDNA，用实时荧光定量 PCR仪检测干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α） mRNA的变化。　　7、ELISA法检测脑组织上清中细胞因子：按0.1 g脑组织加入1 ml PBS（pH7.2～7.4），在冰浴下充分匀浆，低温高速离心收集上清液冻存以备细胞因子检测。采用双抗夹心ELISA法动态监测脑组织中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α的变化。统计分析时细胞因子含量以均数±标准差表示。　　8、隐性感染小鼠模型的复发诱导：取感染2月的实验小鼠及正常小鼠，每天腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg.d），隔天检测小鼠体重、全血白细胞数和全血中弓形虫B1基因，以了解小鼠免疫力情况和虫血症出现情况；同时处死濒死小鼠，取肝、脾和肺组织作冰冻切片，一张用于HE染色以观察组织病理变化，另一张用作免疫荧光检测弓形虫抗原，以了解全身性弓形虫病的情况。　　9、用于药物保护效果研究的实验动物分组：将感染弓形虫2月后的ICR小鼠按以下方法进行分组：感染+环磷酰胺组（In+CTX），感染+环磷酰胺+氟康唑组（In+CTX+F），感染+环磷酰胺+伊曲康唑组（In+CTX+I），感染+环磷酰胺+阿奇霉素组（In+CTX+A），阿奇霉素浓度为250 mg/kg.d，氟康唑和伊曲康唑组根据浓度不同又分为20 mg/kg.d、30 mg/kg.d和40 mg/kg.d三个组，同时设置对照-正常小鼠+环磷酰胺（N+CTX）和感染组（In）。除In组外，其余各组每天腹腔注射环磷酰胺（100mg/kg.d），同时In+CTX+F、In+CTX+I和In+CTX+A组小鼠用灌胃方法分别喂食不同浓度的氟康唑、伊曲康唑和阿奇霉素，连续用药14 d。　　10、计算各组小鼠的存活率及脑组织包囊数，实验组和对照组的显著性检验采用SPSS11.5统计软件分析处理。　　结果：　　1、病程及临床症状：ICR小鼠于感染后第6天开始出现食欲减退、耸毛、怠惰、抖动，接着出现腹胀、腹泻、体重减轻等症状，部分小鼠死亡（死亡率约20％）。剖检死亡小鼠见肝脾肿大和腹水增加，腹水涂片和组织印片均可见弓形虫速殖子。但从第20天开始，存活的小鼠开始逐渐恢复，至第30天，小鼠均表现为皮毛光滑、食欲好，体重渐增。继续饲养直至180天无异常。　　2、小鼠全血中弓形虫B1基因检测：从感染第5 d至第25 d取感染组小鼠全血中查见弓形虫B1基因特异性片段，说明在血液中存在弓形虫速殖子。　　3、组织中弓形虫B1基因检测：肝和脾脏在感染第5 d～25 d组织DNA中可查见弓形虫B1基因特异性片段，肺脏在感染5 d～30 d组织DNA中可检测到弓形虫B1基因特异性片段。然而，在脑组织在感染第10 d～180 d均能检测到弓形虫B1基因特异性片段。　　4、免疫组织化学检测结果：在感染第5 d～25 d肝和脾脏、感染第5 d～30 d肺脏，及感染第10 d脑组织的多种细胞胞浆和胞核中均发现了弓形虫抗原，并在感染第15 d后的脑组织中发现弓形虫包囊。　　5、肝、脾、肺、肾和心组织病理学改变：这些器官在感染5 d时出现病变，第10 d时病理改变最重，其中肝、脾和肺组织病理损害最严重，主要表现为组织结构破坏、细胞变性坏死、血管扩张充血及大量炎症细胞浸润，第20 d后病变明显减轻，损伤开始恢复。　　6、脑组织病理改变：在感染5 d时小鼠脑组织未见明显病理变化，在第10 d时局部脑组织观察到细胞变性坏死，第15 d后可见明显脑膜脑炎病理损害与弓形虫包囊共存。　　7、细胞因子检测结果：实时荧光定量PCR法和ELISA法检测发现，相对于正常对照组，感染小鼠脑组织中IFN-γ于感染后第5 d开始升高，第10 d时下降达到最低，之后开始上升；TNF-α在感染第10 d或15 d时明显降低，接着上升并于第30 d时达到高峰；IL-6在感染第5 d时开始升高，感染第10 d时降至最低，之后缓慢上升，并于第30 d后达到高峰；IL-4是4个细胞因子中变化最小的，仅仅围绕阴性对照波动。　　8、感染小鼠复发诱导结果：感染小鼠注射环磷酰胺后第8 d开始出现耸毛、怠惰、抖动、食欲下降及腹泻等临床表现；与实验前比较，小鼠体重和全血中白细胞数明显下降；第10 d时全血中再次发现弓形虫B1基因特异性片段，说明弓形虫虫血症重新出现；第10 d后濒死小鼠的肝、脾和肺组织中检测到弓形虫B1基因特异性片段，冰冻切片HE染色发现明显病理损伤，免疫荧光检测发现弓形虫抗原。　　9、三唑类药物对诱导复发急性弓形虫病小鼠存活率的影响：实验结束时，In+CTX组小鼠全部死亡，In+CTX+A组、N+CTX组及In组小鼠全部存活，In+CTX+A组与In+CTX组存活率有显著差异（P=0.016）。In+CTX组、F组、I组和A组对复发急性弓形虫病小鼠的存活情况是不一样的（P=0.000），阿奇霉素效果好于氟康唑（P=0.001），而氟康唑作用强于伊曲康唑（P=0.000）。但是氟康唑或伊曲康唑组由于药物剂量不同所导致的存活率是没有区别的。　　10、三唑类药物对诱导复发急性弓形虫病小鼠脑组织包囊数的影响：In+CTX组与In组、F组、I组和A组比较，小鼠脑组织包囊数量明显增加了（P=0.001），但是A、I、F和In之间的包囊数差别是无统计学意义的，F组和I组各个浓度之间包囊数的差别也是无统计学差异的。　　结论：　　1、弓形虫Prugniaud株感染ICR小鼠后，其病程特点为早期出现急性弓形虫病症状，部分小鼠死亡；然而在渡过急性期后大多数小鼠均能逐渐恢复，急性症状消失而转为慢性及隐性感染，直至外观健康的带虫状态。　　2、急性期的主要病理变化为弓形虫速殖子大量寄生所导致的多个重要内脏器官的组织细胞变性、坏死和炎症细胞浸润等非特异性炎症病理改变，这可能是部分小鼠死亡的主要原因。急性期后内脏器官弓形虫消失，但又表现为弓形虫侵入脑组织并形成包囊，弓形虫包囊寄生在脑组织内可造成局灶性脑组织细胞损害，但也可表现为与脑组织共存。宿主在外观行为上并未见到明显的脑神经系统损害的表现。弓形虫包囊可长期存在于脑组织中。　　3、在弓形虫Prugniaud株感染ICR小鼠的过程中，脑组织中IFN-γ、IL-6和TNF-α细胞因子在感染第10 d或15 d的低表达有利于弓形虫逃避宿主的免疫杀伤作用，之后这些细胞因子开始升高；而整个实验过程中，IL-4表达量较低。致炎细胞因子的升高和抗炎细胞因子的低表达，导致细胞因子分泌的不平衡，Th1/Th2细胞发生漂移，最终导致小鼠出现脑组织中弓形虫包囊与病理变化共存的隐性感染状态。　　4、环磷酰胺可以成功地诱导脑部隐性弓形虫感染的小鼠复发为全身性的急性弓形虫病。阿奇霉素、氟康唑和伊曲康唑可以对弓形虫复发过程中的小鼠产生保护作用，其中阿奇霉素效果最好，氟康唑和伊曲康唑能起到一定作用，且前者较后者的作用更强一些。因此，该药可以作为临床上免疫低下患者同时并发弓形虫及其他机会性真菌感染时的备选药物。