果聚糖(Fructan)包含低聚果糖、高聚果糖,是一类主要以果糖残基为单体聚合而成的多糖,分子量范围分布较广。高聚果糖通常分为两大类,一类主要由β-(2,1)糖苷键连接而成,归类为菊糖(Inulin);另一类通常是以β-(2,6)糖苷键连接而成,归类为左聚糖或细菌型果聚糖(Levan)。果聚糖已经被证实具有多种生物学活性,在抗肿瘤,抗病毒,增强身体免疫等方面都有一定的效果。果聚糖还具有增强免疫应激,改善肠道失衡的功能,并且是一种很重要的食品添加剂,可以用于益生元、膳食纤维、低热食品、减肥产品、降脂产品生产,还可以作为乳化剂、保湿剂、凝胶剂等等使用。左聚糖在保湿性能上和目前化妆品行业需求大价格高昂的透明质酸具有同等效果,在化妆品行业的应用有极大潜力。地处亚热带的广西目前已经是全国最大的蔗糖生产基地,产量占全国蔗糖产量的60%以上。但是广西的蔗糖产业一直存在产品线比较单一,缺少高附加值产品的缺陷。利用蔗糖为原料开发高附加值产品符合地方经济可持续发展的需要,具有很大的意义。左聚糖蔗糖酶(levansucrase)又称为果糖基转移酶(fructosyltransferase,FTF,FTase,sucrose:2,6-D-fructan-6-D-fructosyltransferase,Lls,EC2.4.1.10),是一类可以将蔗糖水解成果糖和葡萄糖,并且可以将果糖基转移形成果聚糖的酶。本论文研究目的是利用现代微生物生物技术、分子酶工程等先进手段,克隆、表达并改造新的左聚糖蔗糖酶基因,以期提高其活力、稳定性和底物耐受性,并研究重组蛋白的酶学性质和其催化左聚糖形成的机制,为今后规模生产左聚糖打下应用研究基础。通过研究还可以比较和分析不同左聚糖蔗糖酶基因及其突变体的蛋白质结构差异和酶学性能差异,对研究糖苷水解酶大家族GH-J的催化结构域及有关左聚糖蔗糖酶活力、稳定性、产物谱的关键氨基酸残基的功能和机理研究提供理论支持。从土壤中分离了枯草芽孢杆菌sp.54A并通过物理诱变获得它的突变株sp.56A;从云南腾冲热海的温泉中分离了嗜热地芽孢杆菌sp.HB1。从比利时菌种保藏中心(BCCM)购买了Geobacillus thermoleovorans LMG9823。对所分离和购买的菌株进行了 16SrDNA序列分析比对,构建了它们之间的系统发育树。根据Genebank公布的左聚糖蔗糖酶序列设计引物,成功克隆了上述芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶基因。建立了未有报道过的一种基于 HSAB(High Concentration Sucrose and Aniline Blue Plate)筛选平板培养基的高效方法。利用苯胺兰染色选择产多糖微生物,利用培养基中高达10%的蔗糖浓度可以同时检测菌株左聚糖蔗糖酶聚合酶能力和水解能力。利用显色和水解圈双重指标筛选左聚糖蔗糖酶野生型菌株。HSAB平板的高渗透压使得它并不适合用于大肠杆菌重组子的筛选。于是我们又建立了一步法高效筛选左聚糖蔗糖酶重组子的平板选择方法。该方法是对文献报道的两步法筛选左聚糖蔗糖酶重组子方法的改进。以SS56A为模板构建了易错PCR的左聚糖蔗糖酶突变体库。通过一步法高效筛选突变体。获得了仅有一个氨基酸残基发生改变的突变体T305A(EPSS1),其在305位发生了 ALA替换THR。在左聚糖蔗糖酶SS56A的碳末端融合了来自Thermus thermophilus TtHB-8的一段与海藻糖合成酶热稳定性相关的结构域,构建了左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6。分别以pSE380和pET30a(+)为基础,构建了重组左聚糖蔗糖酶SS54A、SS56A、T305A、HBR1、9823SB、融合蛋白STHB6的表达载体,在XL10 GOLD和Rossette(DE3)宿主中成功诱导表达。所得重组蛋白经过镍亲和层析纯化,达到电泳纯。对各重组左聚糖蔗糖酶的水解活力酶学性质进行了研究,结果表明它们的性质各有差异。其中SS54A的最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,Km值为5.71 mM蔗糖;Vmax 值为 3.2341μmol/min.mg protein。SS56A 的最适反应温度为45℃,最适pHH为为6.0,Km 值为 6.216 mM 蔗糖;Vmax 值为 43.29μmol/min.mg protein。T305A 的最适反应温度为 50℃,最适 pH 为 6.5,Km 值为 14.52 mM 蔗糖;Vmax 值为 64.52μmol/min.mg protein。STHB6的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,Km值为7.673 mM蔗糖;Vmax值为27.70μmol/min.mg protein。研究还表明左聚糖蔗糖酶的热稳定性受到不同pH的影响。多种金属离子、表面活性剂对水解活力有显著影响。MnC12表现出最强的激活作用,柠檬酸铁铵、CaC12、DTT也有显著激活作用。而AgN03、MgC12、SDS则有明显抑制作用。突变体T305A的底物亲和力有明显下降,但是水解活力具有相对较好的热稳定性,而且催化速度有明显提升,其Vmax比模板SS56A提升了 49%。T305A还能在较高温度和高底物浓度下保持生产左聚糖的高转化率。已有大多数文献报道的左聚糖蔗糖酶聚合生成左聚糖的最适蔗糖底物浓度都在5%-10%之间。而T305A在pH7.0,30℃,25%蔗糖底物浓度条件下反应24小时最高可达到多糖对果糖转化率71.36%。融合蛋白STHB6的Km略有增高,水解蔗糖的速度有一定下降,但是其在高温下聚合生成左聚糖的效率显著提高,生成左聚糖的最适温度提高到40℃,其在25%蔗糖底物浓度时于37℃反应30小时多糖对果糖转化率可以达到80.64%。结合同源建模比对分析突变体并预测有关氨基酸残基功能。首次发现了枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶的ALA-309氨基酸残基对于该酶的热稳定性、催化速度有显著的影响。比较本研究中获得的SS54A、SS56A和T305A(EPSS1)左聚糖蔗糖酶,这三个重组蛋白相互之间仅有一个氨基酸残基的差异。在SS54A重组蛋白中VAL替代了 ALA-309,其余氨基酸序列与SS56A完全一致。但SS54A的最适反应温度仅为35℃,而SS56A最适反应温度为45℃。SS54A的底物亲和能力(Km值为5.71 mM蔗糖)比SS56A(Km值为 6.216 mM)略高,但 Vmax(3.2341μmol/min.mg protein)值仅有 SS56A(43.29μmol/min.mgprotein)的7.5%,催化能力显著降低。目前尚未有文献报道过ALA-309氨基酸残基对左聚糖蔗糖酶结构和性能的影响。通过对重组左聚糖蔗糖酶生成左聚糖的酶学性质的研究,表明其最适温度、pH和底物浓度存在一定差异。获得的左聚糖蔗糖酶突变体T305A、STHB6显示了在高温、高底物浓度条件下保持果聚糖高转化率的性能。这些性能都是目前文献报道的左聚糖蔗糖酶较为缺乏的。多数报道的左聚糖蔗糖酶聚合果聚糖的最适底物浓度仅为5%-10%,一些酶合成果聚糖的最适温度为4℃,这些都是会影响实际生产的限制因素。我们的突变体酶具备了在高温(40℃)、高底物浓度(25%蔗糖)条件下的高转化率(对果糖70%-80%),具备了潜在的生产应用价值。总之,通过研究,我们建立了新的高效的左聚糖蔗糖酶野生菌和重组子筛选平台,筛选到多个性能优异的左聚糖蔗糖酶基因,并通过分子改造获得了性质不同的突变体酶,发现了一些和左聚糖蔗糖酶催化功能密切相关的重要氨基酸残基,这对于深入研究左聚糖蔗糖酶催化结构域以及具有同类催化结构域的糖苷水解酶家族GH68中相关酶的关键氨基酸残基的功能具有重要意义。