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背景：鼻咽癌系我国南部及东南亚地区常见头颈部恶性肿瘤之一,放射治疗为其首选治疗手段,但放疗抗拒的存在限制了其疗效。肿瘤放疗抗拒的产生是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程,细胞内或者放疗过程中细胞出现对放射线抗拒的细胞成分是肿瘤放疗抵抗产生的重要原因。已有的研究显示DNA修复基因蛋白表达量增高、细胞乏氧效应、放疗后促血管生成效应以及自噬性调节是肿瘤细胞对抗放射线的主要途径。但放疗抗拒的具体分子机制目前仍不清楚。microRNA (miRNA)是一种内源性非编码RNA,通过结合到靶基因mRNA3’非翻译区(3’UTR)抑制其翻译等机制,调控靶基因mRNA的转录进而影响靶蛋白质的表达。miRNA参与到肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种恶性生物学行为的调控中。已有研究证实miRNA参与肿瘤放疗敏感性的调控。对放疗抵抗细胞或组织表达改变的miRNA的筛选,将对鼻咽癌放疗抵抗性的逆转、放疗效果的提高提供新的启示和依据。目的：(1)利用X线梯度照射法建立人鼻咽癌放射抗拒细胞(CNE-2-Rs),为研究放射抗拒机理提供可比性的成对细胞株。(2)Illumina Hiseq2000测序系统检测,与已知数据库进行比对,从两样本RNA中筛选出差异表达miRNA,构建放疗抵抗microRNA表达谱。通过生物信息学分析差异表达miRNA与及其靶基因,研究可能的生物学功能和机制通路,为放疗抵抗相关基因表达及其转录后调节提供更直接的科学线索。方法：(1)建立鼻咽癌放疗抵抗细胞株：应用X射线梯度照射的鼻咽癌CNE-2细胞系筛选出放疗抵抗细胞株CNE-2-Rs;CCK-8法检测放射后细胞生存率差异；应用细胞克隆形成试验检测细胞的放疗敏感性；细胞增殖试验检测细胞放射后增殖能力差异。(2)鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱的建立：将建立的放疗抵抗细胞株与其亲代细胞株提取RNA,通过Illumina Hiseq2000测序系统检测,与已知数据库进行比对,从两样本RNA中筛选出差异表达miRNA。将差异表达的miRNA分为上调组和下调组,分别利用Target-Scan5.1与PicTar2种计算方法对选定的miRNA进行靶基因预测,交集的基因集合分别进行GO富集分析和KEGG分析,预测可能的靶基因和信号通路。结果：(1)X线梯度照射可诱导建立鼻咽癌抵抗细胞：①不同放疗剂量下,CCK-8法检测细胞株CNE-2-Rs的生存率高于CNE-2；②CNE-2-Rs放疗后的增殖能力高于CNE-2,放疗抑制率低于CNE-2；③细胞株CNE-2-Rs集落形成能力强于CNE-2细胞,多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,相关指标均提示CNE-2-Rs较CNE-2具有放疗抵抗性,并具有统计学差异(p<0.05)。(2)建立鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱。①筛选出具有差异表达已知miRNA192个(上调107个,下调85个,p<0.05),其中具有显著差异的miRNA50个(Fold-change>1.00或Fold-change<-1.00,p<0.05；上调36个,下调14个)。②21个miRNA簇(cluster)和miRNA家族(family)都存2个以上miRNA表达的差异。信息分析结果：①GO分析提示：下调的14个miRNA对应的靶基因为富集于“生物高聚物修饰(biopolymer modification)"、“蛋白修饰过程(protein modification process)”等28个生物过程(p<0.05)。上调的36个miRNA未发现明显富集的生物过程。②KEGG分析提示：下调的14个miRNA对应的靶基因富集于4条通路“肿瘤相关通路(Pathways in cancer)"、“嘌呤代谢途径(Purine metabolism)"、"Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)”和“轴突导向通路(Axon guidance)"信号通路(q<0.05)；上调的miRNA未有明显的富集通路。结论：(1)本实验通过梯度照射模式证实其可以增加细胞的放疗抵抗性。结果提示,在体外条件下这种筛选模式也可能筛选或诱导出放射抗拒的细胞,为放疗筛选放疗抵抗细胞株提供了一个新的放疗筛选方案。(2)鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱的建立,综合信息学分析提供了数个可能的富集生物过程和富集通路,如Wnt通路和相关microRNA,为我们后续的研究提供了研究的方向和依据。