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研究背景胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,其恶性程度高,侵袭性强,术后易复发,是最棘手的难治性肿瘤之一。高度恶性的多形性胶质母细胞瘤患者的1年和2年生存率分别为58%和31%。对胶质瘤发病机制的研究和寻找新的治疗靶点是胶质瘤研究领域亟待解决的基本问题。神经菌毛素-1(Neuropilin-1,NRP-1)是细胞膜表面的一种单向跨膜糖蛋白,主要表达在血管内皮细胞、肿瘤细胞及神经细胞等,属于非酪氨酸激酶辅助受体。在人类多种肿瘤组织中,NRP-1均有过度表达的现象,对相关肿瘤的发生发展起着重要促进作用。研究发现,脑胶质瘤患者的病理标本中,NRP-1亦呈现高表达,且与胶质瘤的恶性程度及患者预后密切相关。目前NRP-1在脑胶质瘤发生发展中的作用及其分子机制尚未完全明确,阻碍了胶质瘤的分子机制研究及以NRP-1作为干预靶点探索胶质瘤治疗新方法的进程。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)通路是经典的细胞信号转导途径,具有调节细胞增殖、分化、存活、转化及凋亡等多重功能,与胶质瘤的发生、发展、侵润、转移及预后等相关密切。而NRP-1对脑胶质瘤的影响是否与MAPK信号通路有关,目前国内外尚未见相关报道。第一部分NRP-1在脑胶质瘤细胞系中的表达及高效NRP-1siRNA序列的设计、合成和筛选目的观察NRP-1蛋白在不同胶质母细胞瘤细胞系的表达情况,选取NRP-1呈现较高表达的细胞系用于本实验,以及设计、合成和筛选高效NRP-1siRNA序列。材料和方法1.运用Western blot(蛋白免疫印迹法)检测恶性胶质瘤细胞系LN319、U373MG、U87MG、U118MG和U251MG中NRP-1蛋白的表达情况。2.订购Ambion公司化学合成的siRNA,靶向NRP-1基因的两个目标序列分别为：NRP-1siRNAl,5’-AAGCTCTGGGCATGGAATCAG-3’; NRP-1siRNA2,5’-AAAGCCCCGGGTACCTTACAT-3’。将U373MG细胞(Western blot结果显示其为NRP-1表达水平较高的胶质母细胞瘤细胞系)分组为：空白对照组、阴性对照组(control siRNA)、NRP-1siRNAl组和NRP-1siRNA2组。采用Lipofectamine2000(脂质体2000)作为转染试剂,将U373MG细胞分别转染NRP-1siRNA1、NRP-1siRNA2或control siRNA后,采用RT-PCR法(逆转录-聚合酶链反应)和Western blot法检测不同处理组NRP-1mRNA和NRP-1蛋白的表达情况。结果1.恶性胶质瘤细胞系U373MG、U87MG、LN319和U118MG中NRP-1蛋白均呈现阳性表达,其中LN319和U373MG中NRP-1蛋白呈现较高水平的表达。而在U251MG细胞系中NRP-1蛋白表达不明显。2.半定量RT-PCR结果显示：NRP-1siRNA1组和NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,NRP-1mRNA水平分别降低约50%(P<0.01)和85%(P<0.001)。Western blot结果与RT-PCR一致：NRP-1siRNAl组和NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,NRP-1蛋白水平分别降低约47%(P<0.05)和77%(P<0.01)。小结LN319和U373MG细胞系NRP-1蛋白均呈现较高水平的表达,选取胶质母细胞瘤U373MG细胞系用于本实验(LN319非胶质母细胞瘤细胞系)。NRP-1siRNA1和NRP-1siRNA2序列均可显著抑制U373MG细胞NRP-1的表达,其中NRP-1siRNA2序列抑制效果更明显,故选取该序列用于以下实验。第二部分siRNA靶向抑制NRP-1表达对U373MG胶质瘤细胞生长的影响目的本研究拟利用siRNA技术,特异性地抑制体外培养的脑胶质瘤细胞中NRP-1基因的表达,观察伴随NRP-1表达水平下降脑胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化情况,初步探讨NRP-1在脑胶质瘤细胞生长中的作用。材料和方法常规方法培养U373MG细胞,取对数生长期的细胞作为研究对象。1.采用MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法,检测NRP-1siRNA2或control siRNA转染U373MG细胞24h、48h和72h后,对细胞增殖的影响。2.采用Annexin V-FITC/PI双染法分析NRP-1siRNA2或control siRNA转染U373MG细胞48h后的细胞凋亡情况。3.运用流式细胞仪分析NRP-1siRNA2或control siRNA转染U373MG细胞48h后,不同处理组细胞周期的分布情况。结果1.转染24h后,NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,细胞增殖率无明显变化。转染48h后,NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,细胞增殖率降低约32%(P<0.05)。转染72h后,NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,细胞增殖率降低约43%(P<0.01)。2.转染48h后,NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,细胞凋亡增加接近2倍(P<0.01)。3. NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,G1期细胞数目显著增加(P<0.01),而S期细胞数目显著减少(P<0.01)。小结siRNA沉默U373MG细胞NRP-1表达后,可显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和延迟细胞周期进入有丝分裂期。NRP-1siRNA对胶质瘤U373MG细胞增殖的抑制作用,可能与其诱导细胞周期阻滞在G1期(有丝分裂前期),延迟进入有丝分裂阶段有关。第三部分NRP-1siRNA对U373MG细胞生长的影响与ERK、JNK/MAPK信号通路的关系目的观察siRNA下调NRP-1表达对ERK、JNK/MAPK信号通路水平的影响。初步探索NRP-1对脑胶质瘤生长的影响与MAPK信号通路的关系。材料和方法1.采用Western blot法检测NRP-1siRNA2和control siRNA转染U373MG细胞48h后,不同处理组BCL-2家族促凋亡蛋白BAD和抑凋亡蛋白BCL-2的表达水平。2.采用Western blot法检测NRP-1siRNA2和control siRNA转染U373MG细胞48h后,不同处理组MAPK通路信号分子P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK和JNK蛋白的表达水平。结果1. NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,BCL-2总蛋白和p-BAD-Serl12蛋白水平分别降低约55%和45%,BAD总蛋白水平没有明显差异。2. NRP-1siRNA2组与空白对照组相比,p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平分别降低约87%和72%,而总ERK1／2和JNK蛋白的水平无明显改变。小结1. ERK、JNK/MAPK信号通路的失活可能是NRP-1siRNA对U373MG细胞生长影响的分自机制之一。信号通路失活的原因可能与ERK1/2和JNK的磷酸化激活过程受抑制有关,而信号分子的蛋白表达过程可能未受影响。2. NRP-1siRNA2转染U373MG细胞后,BCL-2家族成员蛋白水平发生改变,促凋亡作用增强。机制可能与JNK信号通路失活,而减少了对下游靶分子Bcl-2和Bad蛋白的活化有关。1. siRNA沉默U373MG细胞NRP-1表达后,可显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和改变细胞周期分布。2. NRP-1siRNA使胶质瘤U373MG细胞周期阻滞在G1期,延迟细胞进入有丝分裂阶段可能是U373MG细胞增殖受到明显抑制的原因之-3. ERK、JNK/MAPK信号通路的失活可能是NRP-1siRNA对U373MG细胞生长影响的分子机制之一。信号通路失活的原因可能与ERK1/2和JNK的磷酸化激活过程受抑制有关,而信号分子的蛋白表达过程可能未受影响。4. NRP-1siRNA2转染U373MG细胞后,BCL-2家族成员蛋白水平发生改变,促凋亡作用增强。机制可能与JNK信号通路失活,而减少了对下游靶分子Bcl-2和Bad蛋白的活化有关。