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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种高度接触性、致死性传染病,由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)的广泛应用,有效地控制了猪瘟的爆发和大流行。但猪瘟在我国仍持续存在,呈现诸如非典型猪瘟、慢性猪瘟和持续感染等特点,给养猪业造成巨大危害。深入研究CSFV基因组编码蛋白的结构与功能,进而阐明病毒致病机制,是猪瘟病毒研究的重要方向之一。在CSFV基因组上,p7位于E2与NS2之间,是一种多功能离子通道蛋白,也是CSFV的毒力因子之一。在黄病毒科成员中,只有丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)和瘟病毒编码p7蛋白。目前已知HCV p7蛋白具有离子通道活性,通过介导病毒蛋白之间相互作用参与病毒粒子组装。但对瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中作用的认识明显不足。为了揭示瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中的作用,首先构建了 CSFVp7、E2和NS2真核表达质粒,研究了 p7与E2和NS2之间的相互作用。免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation assays,Co-IP)和荧光共聚焦(Confocal)实验结果证实,p7与NS2、E2与NS2、p7与p7之间存在蛋白-蛋白相互作用;而p7和E2的相互作用相对较弱。E2、p7和NS2蛋白在细胞中能够形成蛋白质复合物。通过分别构建p7和NS2的截短突变体,进行Co-IP和Confocal实验,研究发现p7第一个跨膜结构域(TM1)和NS2的TM1是二者相互作用的关键区域。另外,我们还构建了 E2p7前体蛋白和p7NS2联体蛋白的真核表达质粒,通过Co-IP和Confocal实验研究发现,与E2蛋白相比,E2p7前体蛋白与NS2或p7NS2的相互作用显著增强。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,构建了 E2p7切割功能失活的cDNA克隆pSIM/E2ASG/NSR和p7中心区域缺失的cDNA克隆pSM/△p715-51。病毒拯救分析显示,E2p7切割功能失活或p7中心区域缺失导致无感染性病毒产生。在E2和p7切割位点之间插入核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES),构建了双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,仍能有效拯救出CSFV。然而,与感染性cDNA克隆pSM相比,双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES拯救出的CSFV滴度显著降低,表明E2p7前体蛋白切割产生成熟的E2和p7蛋白为感染性病毒产生所必需,而E2p7前体蛋白的存在能够促进感染性病毒的产生。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,我们对p7蛋白N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变,对p7 N端TM1不同性质的代表性氨基酸进行单个或三个位点突变。病毒拯救分析显示,除p7YFY25/26/30AAA完全阻碍感染性病毒产生外,其它所有位点突变均导致显著降低的感染性病毒产生,表明p7N末端1-9位氨基酸和TM1的氨基酸在调节感染性病毒产生中发挥作用。基于pSM/E2/IRES反向遗传操作,对p7 N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,这些位点突变不影响或一定程度上调病毒产生,表明p7 N末端氨基酸对感染性病毒产生的调节一定程度上与影响E2p7前体蛋白的切割密切相关。通过构建p7 TM1三个位点突变的真核表达质粒进行Co-IP实验,研究发现p7 突变体如 p7TD118/19/20AAA、p7EVV21/22/23AAA或p7YFY25/26/30AAA与NS2的相互作用显著减弱,表明p7和NS2的相互作用是影响感染性CSFV产生的重要因素之一。为了研究p7在病毒基因组复制中的作用,选取了包含代表性p7突变位点(p7Q5A、p7V8A、p7V9A、p7Y30A、p7TD118/19/20AAA、p7EVV212223AAA)的单顺反子 cDNA 克隆进行基因组复制分析。结果显示,CSFVp7N端氨基酸突变不影响病毒基因组复制,暗示p7调节感染性病毒产生发生在基因组复制后的病毒蛋白加工及病毒粒子成熟阶段。本论文的研究结果有助于加深对猪瘟病毒基因组结构与功能、病毒复制调控和致病机制的理解,对于发展猪瘟防控新策略等有重要意义。