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目的：
1.明确NQO1抑制剂DIC对HBV转录复制的调控作用。
2.解析NQO1调控HBx蛋白稳定性的分子机制。
3.阐明NQO1稳定HBx蛋白对cccDNA转录和HBV复制过程的重要作用。
4.探究NQO1/HBx调控cccDNA转录的分子机制。
5.体内实验充分评估NQO1抑制剂DIC的抗HBV效能。
方法：
1.利用Nano-Glo?HiBiTLyticDetectionSystem评估NQO1抑制剂DIC对病毒蛋白HBx表达水平的调控作用；Westernblot检测DIC对外源性和内源性HBx蛋白水平的影响。
2.在HBV感染的HepG2-NTCP中，使用不同浓度的DIC处理细胞：real-timePCR(RT-PCR)检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平；Northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平；Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测HBVcccDNA水平。
3.在HepG2细胞中敲减/敲除或过表达NQO1，共转染HBx：Westernblot和RT-PCR检测HBx蛋白和mRNA水平；采用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，westernblot检测HBx蛋白水平。
4.在Huh-7细胞中敲减/敲除或过表达NQO1，共转染HBx，采用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，Westernblot检测HBx蛋白水平；在NQO1基因敲减或敲除的细胞中共转染HBx和HA-Ubiquitin，Co-immunoprecipation方法检测NQO1对HBx泛素化修饰的影响；在Huh-7细胞中转染HBx，通过Co-immunoprecipation方法检测NQO1与HBx、20S蛋白酶体的结合情况。
5.在HBV感染的细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中分别感染表达Vector、NQO1、NQO1mut的慢病毒：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平，qRT-PCR检测HBVcccDNA水平；qRT-PCR和southernblot检测HBVDNA水平。
6.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中过表达NQO1，采用EU处理细胞，RT-PCR检测新生totalHBVRNAs和pgRNA的水平；或采用7-ADD处理细胞，RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平。
7.在HBV感染的细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中敲减NQO1：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平，qRT-PCR检测HBVcccDNA水平，qRT-PCR和southernblot检测HBVDNA水平。
8.在HepG2-NTCP细胞中分别感染野生型(HBV WT)或X基因缺陷型(HBV-ΔHBx)的HBV病毒颗粒，过表达或敲减NQO1：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，qRT-PCR检测cccDNA水平。
9.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，过表达或敲减NQO1，或采用NQO1抑制剂DIC处理细胞，运用cccDNA-ChIP方法检测NQO1过表达、敲减或DIC处理对内源性HBx与cccDNA结合的影响。
10.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，过表达、敲减NQO1或采用NQO1抑制剂DIC处理细胞，运用cccDNA-ChIP方法检测NQO1过表达、敲减或DIC处理对cccDNA上转录活化性(H3K9ac和H3K4me3)和抑制性(H3K9me3和H3K27me3)组蛋白修饰水平的影响。
11.在HBV感染的小鼠模型中，分别采用Vehicle、DIC、ETV处理，ELISA和qRT-PCR分别检测小鼠血清HBsAg和HBVDNA水平；RT-PCR检测小鼠肝脏内totalHBVRNAs和HBV3.5-kbRNA水平；qRT-PCR检测HBVcccDNA水平；IHC检测小鼠肝组织内HBx和HBs表达水平；利用组织特异性ChIP检测HBx与cccDNA的结合水平和活化性/抑制性组蛋白修饰与cccDNA的结合水平。
结果：
1.NQO1抑制剂DIC显著抑制HiBiT-HBx的表达；DIC处理可以显著降低外源性以及内源性HBx蛋白的表达。
2.在HBV感染的HepG2-NTCP中，DIC呈浓度依赖性的降低totalHBVRNAs和pgRNA水平，但对细胞内cccDNA含量无明显影响。
3.敲减/敲除NQO1可降低HBx蛋白水平，而过表达NQO1可升高HBx蛋白水平；但均对HBxmRNA水平无明显影响。采用CHX处理细胞检测HBx蛋白稳定性发现：敲减/敲除NQO1可显著降低HBx蛋白的稳定性，而过表达NQO1可增加HBx蛋白的稳定性。
4.MG132处理可显著恢复NQO1基因敲减/敲除细胞中HBx的蛋白水平，且NQO1对HBx的调控作用不依赖于HBx的泛素化修饰；同时NQO1与HBx、20S蛋白酶体之间存在相互结合。
5.过表达NQO1可升高HBV感染细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中totalHBVRNAs和pgRNA以及HBVDNA水平；尽管感染细胞内HBVcccDNA水平无明显变化，但分析发现cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显升高。
6.过表达NQO1可以促进HBV感染的HepG2-NTCP细胞中新生totalHBVRNAs和pgRNA的表达；但对HBVRNA的降解无明显作用。
7.敲减NQO1可减低HBV感染细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中totalHBVRNAs和pgRNA以及HBVDNA水平；感染细胞内HBVcccDNA水平无明显改变，但cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显降低。
8.在感染野生型HBV病毒颗粒的HepG2-NTCP细胞中，过表达NQO1时cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显升高，而敲减NQO1可降低其转录活性。但NQO1对感染X基因缺陷型HBV病毒颗粒的HepG2-NTCP细胞中cccDNA的转录活性无调控作用。
9.过表达NQO1可升高HBV感染的HepG2-NTCP细胞中HBx与cccDNA的结合水平，而敲减NQO1或NQO1抑制剂DIC可降低两者的结合水平。
10.过表达NQO1可升高HBV感染的HepG2-NTCP细胞中cccDNA结合组蛋白上转录活化性修饰(H3K9ac和H3K4me3)水平，而降低抑制性修饰(H3K9me3和H3K27me3)水平；敲减NQO1或NQO1抑制剂处理则相反。
11.NQO1抑制剂DIC可降低HBV感染小鼠血清HBsAg和HBVDNA水平；同时降低小鼠肝脏内totalHBVRNAs和HBV3.5-kbRNA以及HBx和HBs蛋白表达水平；组织特异性ChIP检测结果显示DIC可抑制HBx与cccDNA的结合，并使cccDNA结合组蛋白上转录活化性修饰(H3K9ac和H3K4me3)水平降低，而抑制性修饰(H3K9me3和H3K27me3)水平升高。
结论：
本研究发现，NQO1抑制剂DIC可显著抑制病毒蛋白HBx的表达，进而抑制HBV的转录复制。进一步研究发现，NQO1通过抑制病毒蛋白HBx经20S蛋白酶体途径的降解使HBx蛋白稳定性增加，进而促进HBV的转录复制。机制研究显示，NQO1通过增加HBx的稳定性，从而改变cccDNA上结合组蛋白转录修饰水平，最终促进cccDNA的转录。体内实验也证实NQO1抑制剂DIC可抑制HBx的表达以及HBV的转录复制。综上，本研究解析了NQO1调控HBx蛋白稳定性的分子机制，阐明了NQO1稳定HBx蛋白对cccDNA转录和HBV复制过程的重要作用，通过体内外实验充分评估了NQO1抑制剂DIC的抗病毒效能。
1.明确NQO1抑制剂DIC对HBV转录复制的调控作用。
2.解析NQO1调控HBx蛋白稳定性的分子机制。
3.阐明NQO1稳定HBx蛋白对cccDNA转录和HBV复制过程的重要作用。
4.探究NQO1/HBx调控cccDNA转录的分子机制。
5.体内实验充分评估NQO1抑制剂DIC的抗HBV效能。
方法：
1.利用Nano-Glo?HiBiTLyticDetectionSystem评估NQO1抑制剂DIC对病毒蛋白HBx表达水平的调控作用；Westernblot检测DIC对外源性和内源性HBx蛋白水平的影响。
2.在HBV感染的HepG2-NTCP中，使用不同浓度的DIC处理细胞：real-timePCR(RT-PCR)检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平；Northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平；Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测HBVcccDNA水平。
3.在HepG2细胞中敲减/敲除或过表达NQO1，共转染HBx：Westernblot和RT-PCR检测HBx蛋白和mRNA水平；采用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，westernblot检测HBx蛋白水平。
4.在Huh-7细胞中敲减/敲除或过表达NQO1，共转染HBx，采用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，Westernblot检测HBx蛋白水平；在NQO1基因敲减或敲除的细胞中共转染HBx和HA-Ubiquitin，Co-immunoprecipation方法检测NQO1对HBx泛素化修饰的影响；在Huh-7细胞中转染HBx，通过Co-immunoprecipation方法检测NQO1与HBx、20S蛋白酶体的结合情况。
5.在HBV感染的细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中分别感染表达Vector、NQO1、NQO1mut的慢病毒：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平，qRT-PCR检测HBVcccDNA水平；qRT-PCR和southernblot检测HBVDNA水平。
6.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中过表达NQO1，采用EU处理细胞，RT-PCR检测新生totalHBVRNAs和pgRNA的水平；或采用7-ADD处理细胞，RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平。
7.在HBV感染的细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中敲减NQO1：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，northernblot检测HBV3.5-kb和2.1/2.4-kbRNA水平，qRT-PCR检测HBVcccDNA水平，qRT-PCR和southernblot检测HBVDNA水平。
8.在HepG2-NTCP细胞中分别感染野生型(HBV WT)或X基因缺陷型(HBV-ΔHBx)的HBV病毒颗粒，过表达或敲减NQO1：RT-PCR检测totalHBVRNAs和pgRNA的水平，qRT-PCR检测cccDNA水平。
9.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，过表达或敲减NQO1，或采用NQO1抑制剂DIC处理细胞，运用cccDNA-ChIP方法检测NQO1过表达、敲减或DIC处理对内源性HBx与cccDNA结合的影响。
10.在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，过表达、敲减NQO1或采用NQO1抑制剂DIC处理细胞，运用cccDNA-ChIP方法检测NQO1过表达、敲减或DIC处理对cccDNA上转录活化性(H3K9ac和H3K4me3)和抑制性(H3K9me3和H3K27me3)组蛋白修饰水平的影响。
11.在HBV感染的小鼠模型中，分别采用Vehicle、DIC、ETV处理，ELISA和qRT-PCR分别检测小鼠血清HBsAg和HBVDNA水平；RT-PCR检测小鼠肝脏内totalHBVRNAs和HBV3.5-kbRNA水平；qRT-PCR检测HBVcccDNA水平；IHC检测小鼠肝组织内HBx和HBs表达水平；利用组织特异性ChIP检测HBx与cccDNA的结合水平和活化性/抑制性组蛋白修饰与cccDNA的结合水平。
结果：
1.NQO1抑制剂DIC显著抑制HiBiT-HBx的表达；DIC处理可以显著降低外源性以及内源性HBx蛋白的表达。
2.在HBV感染的HepG2-NTCP中，DIC呈浓度依赖性的降低totalHBVRNAs和pgRNA水平，但对细胞内cccDNA含量无明显影响。
3.敲减/敲除NQO1可降低HBx蛋白水平，而过表达NQO1可升高HBx蛋白水平；但均对HBxmRNA水平无明显影响。采用CHX处理细胞检测HBx蛋白稳定性发现：敲减/敲除NQO1可显著降低HBx蛋白的稳定性，而过表达NQO1可增加HBx蛋白的稳定性。
4.MG132处理可显著恢复NQO1基因敲减/敲除细胞中HBx的蛋白水平，且NQO1对HBx的调控作用不依赖于HBx的泛素化修饰；同时NQO1与HBx、20S蛋白酶体之间存在相互结合。
5.过表达NQO1可升高HBV感染细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中totalHBVRNAs和pgRNA以及HBVDNA水平；尽管感染细胞内HBVcccDNA水平无明显变化，但分析发现cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显升高。
6.过表达NQO1可以促进HBV感染的HepG2-NTCP细胞中新生totalHBVRNAs和pgRNA的表达；但对HBVRNA的降解无明显作用。
7.敲减NQO1可减低HBV感染细胞(包括HepG2-NTCP和PHH)中totalHBVRNAs和pgRNA以及HBVDNA水平；感染细胞内HBVcccDNA水平无明显改变，但cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显降低。
8.在感染野生型HBV病毒颗粒的HepG2-NTCP细胞中，过表达NQO1时cccDNA转录活性(TotalRNA/cccDNA和pgRNA/cccDNA)明显升高，而敲减NQO1可降低其转录活性。但NQO1对感染X基因缺陷型HBV病毒颗粒的HepG2-NTCP细胞中cccDNA的转录活性无调控作用。
9.过表达NQO1可升高HBV感染的HepG2-NTCP细胞中HBx与cccDNA的结合水平，而敲减NQO1或NQO1抑制剂DIC可降低两者的结合水平。
10.过表达NQO1可升高HBV感染的HepG2-NTCP细胞中cccDNA结合组蛋白上转录活化性修饰(H3K9ac和H3K4me3)水平，而降低抑制性修饰(H3K9me3和H3K27me3)水平；敲减NQO1或NQO1抑制剂处理则相反。
11.NQO1抑制剂DIC可降低HBV感染小鼠血清HBsAg和HBVDNA水平；同时降低小鼠肝脏内totalHBVRNAs和HBV3.5-kbRNA以及HBx和HBs蛋白表达水平；组织特异性ChIP检测结果显示DIC可抑制HBx与cccDNA的结合，并使cccDNA结合组蛋白上转录活化性修饰(H3K9ac和H3K4me3)水平降低，而抑制性修饰(H3K9me3和H3K27me3)水平升高。
结论：
本研究发现，NQO1抑制剂DIC可显著抑制病毒蛋白HBx的表达，进而抑制HBV的转录复制。进一步研究发现，NQO1通过抑制病毒蛋白HBx经20S蛋白酶体途径的降解使HBx蛋白稳定性增加，进而促进HBV的转录复制。机制研究显示，NQO1通过增加HBx的稳定性，从而改变cccDNA上结合组蛋白转录修饰水平，最终促进cccDNA的转录。体内实验也证实NQO1抑制剂DIC可抑制HBx的表达以及HBV的转录复制。综上，本研究解析了NQO1调控HBx蛋白稳定性的分子机制，阐明了NQO1稳定HBx蛋白对cccDNA转录和HBV复制过程的重要作用，通过体内外实验充分评估了NQO1抑制剂DIC的抗病毒效能。