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农药污染的微生物修复被认为是最具有前景的修复方法之一，然而，由于农药污染种类复杂，迫切需要构建多功能的农药降解工程菌来满足生物修复的需求。工程菌实际应用于农药污染的修复必须具有遗传稳定、不含外源抗性等特点，将外源基因通过同源重组的方法整合到受体菌染色体上是一种理想的方法。另一方面，由于转基因微生物（基因工程菌）的复杂性和不确定性，其环境释放的安全性受到广泛关注，因此，工程菌在应用前必须进行环境释放安全性评价。本研究构建了以sacB基因为反筛选标记的同源重组载体，将外源甲基对硫磷水解酶基因mpd整合到呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1的16S rRNA基因（rDNA）位点，构建了遗传稳定、不含外源抗性的能同时降解甲基对硫磷（MP）和呋喃丹的工程菌株，并通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件的发生。mpd基因插入失活一个rrn操纵元对受体菌生理活性和农药降解特性没有负面影响。基因工程菌遗传稳定，经过120代的无选择压力培养，外源mpd基因不丢失。mpd基因整合于rrn位点受到16S rRNA基因强启动子的影响，能增加转录与表达水平，工程菌各个时期内的比酶活均大于出发菌株DLL-1。工程菌即使在外加碳源情况下，能在广泛起始pH、温度、通气量和不同接种量条件下完全降解100mg／kg的MP和呋喃丹农药。构建的基因工程菌株获得农业转基因生物安全管理委员会批准在江苏省进行环境释放的中间试验（农基安办字2003-T285）。为了研究Sphingomonas这类具有重要工业用途和广阔环境修复应用前景菌株的同源重组关键参数，以mpd基因为外源报告基因，不同长度同源臂的同源重组载体为供体DNA和具有不同同源性的Sphingmonas菌株的16S rDNA片段为受体DNA，研究同源重组指导序列的长度和差异性对同源重组效率的影响。结果表明同源臂长度对同源重组的效率影响显著，同源臂最长时同源重组的效率最高，达到5.0±2.10×10-7，当两端的同源臂缩短时，同源重组的效率呈指数下降，Sphingomonas菌株16S rRNA基因位点同源重组的最小片段长度（MEPS）需大于100bp。在Sphingomonas中，发生有效同源重组的供体和受体DNA序列同源性须高于96％。同源重组效率受到序列差异性的显著影响，当供、受体DNA之间存在3-4％的差异性时，同源重组效率相对于100％同源性序列之间下降了3.3到35.7倍。P.putida KT2440菌株中受体DNA与供体DNA之间的同源性为79％，但能在2.8×10-9水平上发生有效同源重组，表明同源重组的效率受到同源性、打靶位点拷贝数和转化效率等多种因素的影响。λRed重组系统能显著提高短同源臂载体的同源重组效率，以99bp的保守16S rDNA序列为同源臂的λRed同源重组载体能够在Sphingomonas agrest CCDS-1、BHC-A和P．putida KT2440中以5.1×10-10～1.1×10-11水平发生有效重组。为提高甲基对硫磷水解酶（MPH）的表达水平，以P．putida KT2440染色体上多拷贝16S rDNA位点为同源重组整合位点，将外源mpd基因多拷贝整合到不同的rDNA位点，分别获得到整合了1-4个mpd基因的重组子。KT2440中7个rrn拷贝中的1-4个被失活，其生长速率与出发菌株相比没有显著差异。同样受rrn位点启动子的影响，mpd基因在rrn位点的整合能提高转录与表达水平，随着mpd基因拷贝数的增加，酶活和比酶活显著增加，KT2440-4mpd最高比酶活达到12.9 mU／μg蛋白，比出发菌株DLL-1提高3.2倍。为延长农药降解基因工程菌剂的货架期，研究了不同载体对菌剂保藏效果，表明草炭的保藏效果最好，可以将液体剂型的20d的保藏期延长到120d，并能维持在109CFU／g载体水平。蛭石的保藏效果较好，是一种比较理想的替代载体。经过120d保藏，在灭菌与未灭菌土壤中投加7.1×107CFU／g干土工程菌均能良好降解50mg&gMP和25mg&g的呋喃丹，MP的降解速率均高于呋喃丹；在灭菌土壤中，两种农药的降解效率快于未灭菌土壤，工程菌数量的下降也较未灭菌土壤慢，在两种土壤中20d和15d后分别检测不到工程菌。为评价基因工程菌的环境释放安全性，在江苏大丰进行了中间试验水平上的安全评价研究。投加1.01×107CFU／g干土的工程菌株在30d时均能完全降解10.71mg／kg的MP和1.29mg／kg的呋喃丹。平板计数表明工程菌在土壤中快速下降；MPN-PCR检测结果显示每克混合土壤中（0-10cm）靶标工程菌在4d，15d和30d的数目分别为2.15±0.98×106，3.70±4.66×104和检测不出。MPN-PCR计数灵敏度要比平板计数法高出1-2个数量级。构建了工程菌Sphingomonas sp.CDS-mpd的特异性荧光原位杂交（FISH）探针，可以专一性的检测到土壤中的靶标工程菌株。三种工程菌检测方法的计数结果表明工程菌在土壤中逐渐消亡，不会成为优势菌，也不会逃逸到释放区外。从土壤可培养微生物三大菌群的计数结果看，工程菌的投加不会对土壤微生物数量产生显著影响。基于通用引物扩增的细菌16S rDNA V3区的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析结果表明农药的施加对细菌菌落结构有显著影响，到60d时细菌群落结构逐渐恢复。工程菌释放在前期对细菌群落结构有一定影响，在工程菌释放后的4d后，相对空白的相似性只有49.57％。在60d时，空白、施药和施菌小区的图谱相似性都在90％以上，表明工程菌释放不会长期影响微生物群落结构，工程菌的释放是安全的。