背景和目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最常见的类型,发病率和死亡率极高。HCC本身是一个多步骤、多阶段发展的疾病,涉及到的调控机制错综复杂,大量基因的异常表达在HCC进展过程中发挥着重要作用。有机阴离子转运多肽1B3(organic anion transporter polypeptide 1B3,OATP1B3)是在正常肝组织上表达的一种膜转运蛋白,可转运激素、药物等内外源性物质。大量研究已报道OATP1B3在胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中的异常表达可以作为患者预后的生物标志物,并参与部分肿瘤进展。在HCC中,OATP1B3的表达水平与肿瘤分化程度显著相关,提示OATP1B3差异表达可能与HCC进展有密切联系。因此,本研究将探讨OATP1B3在HCC中的表达与临床病理学因素和预后的相关性,及其对肝癌细胞生物学功能的影响和作用机制初步探讨。方法:1.查询TCGA数据库,利用Kaplan-Meier法分析OATP1B3 mRNA与302例HCC患者的无瘤生存率和总体生存率的相关性。免疫组织化学染色法检测131例HCC患者癌组织以及89例癌旁正常组织中OATP1B3的表达情况。qRT-PCR检测30对新鲜HCC癌与配对癌旁正常组织中OATP1B3 mRNA的表达水平。Western blot检测34对新鲜HCC癌与配对癌旁正常组织中OATP1B3蛋白表达水平。采集131例HCC患者的临床病理资料和随访信息。χ2检验分析OATP1B3表达与HCC患者临床病理参数的相关性。通过Kaplan-Meier法分析OATP1B3对HCC患者预后评估的价值。Cox比例风险模型分析影响HCC患者生存的独立预后因素。2.体外培养MHCC97-H、SMMC-7721、Huh7、Hep G2和L02细胞,qRT-PCR检测OATP1B3 mRNA在上述5株细胞中的表达情况。选择OATP1B3 mRNA表达水平较高的SMMC-7721细胞构建OATP1B3慢病毒干扰模型,对OATP1B3 mRNA表达水平较低的Huh7细胞构建OATP1B3质粒过表达模型,并通过qRT-PCR和Western blot技术对OATP1B3干扰和过表达效果进行验证。将构建好的SMMC-7721和Huh7细胞进行MTT和克隆形成实验观察OATP1B3对肝癌细胞增殖能力的影响。Transwell和细胞划痕实验观察OATP1B3对肝癌细胞侵袭与迁移能力的影响。利用流式细胞仪检测OATP1B3对肝癌细胞凋亡与周期的影响。3.构建OATP1B3稳定高表达的Hep G2细胞和稳定低表达的SMMC7721细胞。Western blot检测上述细胞中OATP1B3对上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达和Wnt/β-catenin/c-Myc通路活化的影响。将构建的Hep G2和SMMC7721细胞注入裸鼠肝脏包膜下,建立裸鼠肝脏原位癌种植模型,35天后MRI下观察裸鼠肝脏肿瘤转移情况。记录各组裸鼠的存活时间,裸鼠死亡后,解剖并取下肝脏,行肝脏表面大体观察。最后,将裸鼠肝脏肿瘤组织切片,行HE染色并镜下观察。结果:1.根据TCGA数据库分析结果显示,OATP1B3 mRNA高表达的HCC患者总体生存率和无瘤生存率均显著高于低表达者(63.9%vs 26.6%,P=0.005;27.6%vs 13.0%,P=0.017)。免疫组织化学染色法检测结果显示,与癌旁正常组织(25.8%,23/89)相比,OATP1B3在HCC癌组织中表达显著下调(59.5%,78/131)(P<0.0001)。OATP1B3的表达水平与肿瘤大小、复发、肿瘤分化程度、TNM分期显著相关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤包膜、HBs Ag、肝硬化、肿瘤数目、血管侵袭、血清AFP水平无相关性。OATP1B3高表达的HCC患者总体生存率和无瘤生存率均显著高于低表达者(33.0%vs 12.9%,P=0.001;18.8%vs 5.3%,P<0.0001)。Cox比例风险模型分析结果显示OATP1B3、血管侵袭、TNM分期是影响HCC患者总体生存率的独立预后因素(P<0.05);OATP1B3和TNM分期是影响HCC患者无瘤生存率的独立预后因素(P<0.05)。2.OATP1B3 mRNA在人永生化正常肝细胞L02细胞和肝癌细胞SMMC-7721、MHCC97-H、Huh7、Hep G2细胞中的表达量依次降低。成功构建并转染OATP1B3干扰的SMMC-7721细胞模型和OATP1B3过表达的Huh7细胞模型。MTT和克隆形成实验结果表明,上调OATP1B3可抑制肝癌细胞增殖和克隆形成率,下调OATP1B3可促进肝癌细胞增殖和克隆形成率,并呈时间依赖性。Transwell迁移和侵袭实验结果表明,上调OATP1B3可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,下调OATP1B3可促进肝癌细胞的迁移和侵袭。划痕实验结果显示,上调OATP1B3可降低肝癌细胞迁移运动能力,下调OATP1B3可促进肝癌细胞的迁移运动能力。细胞凋亡结果显示,上调OATP1B3可促进肝癌细胞凋亡,下调OATP1B3可抑制肝癌细胞凋亡。细胞周期结果显示,上调OATP1B3可缩短肝癌细胞S期,下调OATP1B3可延长肝癌细胞S期。3.利用慢病毒构建并成功转染Hep G2和SMMC-7721细胞,分别建立OATP1B3稳定过表达和干扰细胞模型。上调OATP1B3表达后,上皮相关标志物E-cadherin表达增加,间质相关标志物Vimentin、N-cadherin以及下游蛋白β-catenin和c-Myc表达降低。下调OATP1B3表达后,上皮相关标志物E-cadherin表达降低,间质相关标志物Vimentin和N-cadherin以及下游蛋白β-catenin和c-Myc表达增加。裸鼠MRI检查和生存时间统计结果显示,上调OATP1B3表达后,肿瘤侵袭转移能力被抑制,裸鼠肝内转移灶数量较少,生存时间较长;下调OATP1B3表达后,肿瘤侵袭转移能力增强,裸鼠肝内转移灶较多,生存时间较短。最后,各组肿瘤组织病理学切片,HE染色可见大量癌巢。结论:1.OATP1B3在HCC中表达下调,其表达水平与患者肿瘤大小、复发、肿瘤分化程度和TNM分期显著相关,再结合TCGA数据库的分析结果,提示OATP1B3可作为HCC患者预后判断的肿瘤生物标志物。2.OATP1B3可抑制肝癌细胞增殖、侵袭与转移,促进细胞凋亡,缩短细胞S期比例。3.OATP1B3可能是通过Wnt/β-catenin/c-Myc通路抑制肝癌细胞的EMT过程。在裸鼠体内,OATP1B3可抑制肝脏原位种植瘤的侵袭与转移。综上,OATP1B3可能通过多种途径在HCC中发挥抑癌作用,并可作为HCC患者预后判断的潜在肿瘤生物标志物。