5一氨基乙酰丙酸(ALA)是一种非蛋白质类五碳氨基酸,是叶绿素和亚血红素和维生素B12等吡咯物质生物合成中重要的前体物质。ALA具有十分重要的应用价值,在农业生产领域,ALA可以作为植物生长调节因子、除草剂和杀虫剂。在医药领域,ALA可以作为光动力学诊断剂和治疗药物应用于肿瘤和皮肤癌治疗。因此,ALA研究价值越来越多的受到研究者的重视,其具有宽阔的市场开发价值和应用前景。目前,工业上ALA的生产主要以化学合成为主,但是化学合成存在步骤繁多、副产物多、得率低和污染环境等缺点。越来越多的研究者专注于利用微生物合成ALA, ALA微生物的合成以C4途径为主,但在该反应中需要添加甘氨酸和琥珀酸等底物,生产成本比较高,不适合大规模工业化地生产ALA。因此本实验室首创以C5途径生产ALA的大肠杆菌工程菌,通过过表达编ALA C5途径两个限速酶基因(编码谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因和编码谷氨酰-1-半醛氨基转移酶hemL基因),以及改造ALA转运系统,成功构建了能够利用廉价的葡萄糖作为唯一的碳源合成ALA的重组大肠杆菌(DALA)。但是该重组大肠杆菌产ALA的最高产量只有4 g/L左右,产量较低；且含有重组质粒,导致菌株发酵不稳定,因此,需要进一步探索优化其发酵条件以降低生产成本和提高ALA产量,同时构建产ALA高稳定性菌株。本论文首先在实验室先前构建的利用C5途径产ALA的的大肠杆菌重组菌株(DALA:E.coil DH5α/pUC19-hemAM-hemL+pCL 1920-rhtA)的基础上尝试使用工业发酵常用的廉价的pH调节剂碳酸钙替代实验室常规的pH调节剂NaOH来调节发酵过程的pH和通过在ALA发酵培养基中添加胰蛋白胨丰富培养基的成分来获得更高的ALA产量。然而通过实验结果发现添加碳酸钙和胰蛋白胨能够影响ALA的积累。本文研究重点是对重组大肠杆菌(DALA)在发酵罐培养中相关的发酵条件,例如发酵温度、pH、溶氧、接种量和N源补加等条件进行优化,确定重组大肠杆菌(DALA)发酵罐最佳的培养条件,在5L发酵罐发酵实验中,重组大肠杆菌(DALA)在发酵培养过程中菌株生长稳定前期转速为400rpm/min,通气量为1.5 vvm,稳定期转速为200rpm,0.5 vvm,发酵后期溶氧降为0%,使重组大肠杆菌处于微好氧状态；整个发酵培养过程温度为37-C；发酵pH在菌株生长稳定前期时为6.5,当达到稳定期时,pH调为6.0。通过优化后发酵条件进行5 L发酵罐培养获得AL A的最高产量达到5.3 g/L,比实验室先期发酵条件优化的5 L发酵罐发酵ALA的产量提高了1.3倍左右。然后尝试将发酵液中的ALA经过一系列粗分离提纯步骤,首先将发酵液中的ALA酸化,以提高ALA的稳定性,高速离心和膜处理除去菌体等杂质,反渗透膜除水,活性炭脱色,旋转蒸发浓缩,冷冻干燥,获取ALA粗制品。发酵生产菌株含有质粒不稳定,易丢失,常常造成产物在生产过程中不稳定。本文通过利用实验室构建的FLP/FRT位点专一性重组法,将产ALA的C5途径中两个关键的基因hemAM-hemL随机整合到敲除arcA和recA基因的DH5a宿主菌中,通过检测拷贝数,获得高拷贝不依赖质粒的稳定地产ALA工业生产菌株。经荧光定量PCR检测获得整合最高6个基因拷贝稳定生产菌株,并对其进行发酵获得ALA的最高产量能达到0.6 g/L。综上所述,本论文在实验室内构建的产ALA的重组菌株(DALA)的基础上,通过多种手段优化发酵条件,提高ALA的产量,也对ALA进行初步的粗分离提取,为实验室以后ALA生产的发酵条件和下游分离提纯提供指导。通过FLP/FRT位点专一性重组法随机在大肠杆菌基因组中整合目的基因,获得稳定地产ALA的生产菌,为下一步工业化生产ALA打下良好基础基础。