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目的：高迁移率族蛋白B1(High mobility group boxl,HMGB1)是机体内含量丰富的一类染色质蛋白,属于高迁移率族蛋白(High mobility group,HMG)家族中的一员,最早由Goodwin和John于20世纪60年代发现,并于1973年首次在牛胸腺中被提取和鉴定。HMGB1是一种典型的核内非组蛋白,在进化过程中其氨基酸序列高度保守,啮齿类动物与人的氨基酸序列同源性高达98％以上,小鼠与大鼠氨基酸序列同源性更是高达100％。长期以来学者们开展大量工作研究其核内功能,包括参与核小体的构建和稳定,调节基因转录,调控甾体类激素受体活性等。1999年,Wang等发现HMGB1可以释放到胞外并介导炎症反应,为一种重要的晚期炎性因子,随后胞外HMGB1的致炎作用引起国内外关注。近年来大量研究显示,单核巨噬细胞经LPS、TNF-α或IL-1刺激后,能主动分泌HMGB1至细胞外,发挥其促炎细胞因子的作用,正反馈刺激单核巨噬细胞释放炎性因子(TNF-α、IL-1α、IL-1β等),介导内皮细胞表达黏附分子(ICAM-1、VCAM-1),活化中性粒细胞,诱导树突细胞成熟,上调其活化标志物CD80、CD83和CD86的表达,增强树突细胞的抗原提呈作用。另外,细胞内HMGB1还可通过坏死细胞的被动释放途径进入胞外或外周循环内,导致巨噬细胞的NF-κ3向核内转移,并产生类似组织坏死后引起的炎性反应,说明被动释放的HMGB1在坏死导致的炎性反应中可能起到了非常重要的作用。现有研究证实,HMGB1在多种疾病的发病过程中扮演着重要的角色,参与内毒素血症、脓毒症、关节炎、感染性休克、缺血-再灌注损伤、自身免疫性疾病以及其他能够引起器官功能障碍或死亡的炎症性疾病。HMGB1在炎症中的核心地位,表明HMGB1很可能成为疾病治疗的有效靶点分子。基于上述研究,本课题拟采用基因工程技术,将HMGB1基因行密码子优化后合成,构建人HMGB1基因原核表达载体,并初步研究其在大肠杆菌中的表达和纯化,获得重组蛋白并进行鉴定,为进一步研究其生物学功能及探讨其调控机制奠定基础。
方法：⑴用OptimumGeneTM软件对人HMGB1原始序列行密码子优化并合成目的基因,插入克隆载体pUC57中构建质粒pUC57-HMGB1。并根据人HMGB1编码序列设计特异性扩增引物,上游引物5端加入起始密码子ATG和限制性酶切位点NdeⅠ,下游引物5端加入限制性酶切位点XhoⅠ,以利于重组表达载体的构建。以质粒pUC57-HMGB1为模板,用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增HMGB1目的基因片段。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析,使用凝胶回收试剂盒纯化。将纯化的目的片段与pMD19-T Simple Vector连接,转化大肠杆菌,接种于终浓度100μg/ml氨苄青霉素的LB平板。经菌落PCR和限制性酶谱分析初步鉴定后,采用ABI3100-Avant全自动DNA测序仪进行测序。测序结果显示：克隆的基因与优化后的HMGB1基因序列完全一致,并成功构建人HMGB1重组质粒pMD19-T/HMGB1。⑵用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切重组质粒pMD19-T/HMGB1,琼脂糖凝胶电泳分离纯化HMGB1片断,插入原核表达载体pQE-T7-2,构建重组HMGB1表达载体pQE-F7-2/HMGB1。经菌落PCR和限制性酶谱分析筛选重组的阳性克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,37℃条件下诱导4小时,分别留取诱导前对照及诱导后菌液,采用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni-NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果显示：成功构建重组HMGB1表达载体pQE-T7-2/HMGB1,表达蛋白约占菌体总蛋白的20％左右,Westem blot显示重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,为特异性HMGB1蛋白,HMGB1融合蛋白以可溶性形式表达,亲和层析纯化后,重组蛋白HMGB1纯度达90％以上。
结论：①成功克隆了人HMGB1基因,序列分析显示,克隆的基因序列与优化合成的序列一致。②成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为下一步研究HMGB1蛋白的生物学功能及其相关疾病奠定了基础。