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研究背景和目的:膀胱癌(Bladder cancer,BC)是我国最常见的泌尿系统肿瘤,其发病率和死亡率均占泌尿系统肿瘤的首位。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的一个重要途径,FAT10(the human HLA-F adjacent transcript 10,FAT10)是唯一能直接介导蛋白酶体降解途径的类泛素蛋白,在调控细胞生物学功能方面发挥重要作用。Survivin属于凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的成员,具有抑制细胞凋亡、促进细胞有丝分裂、调节细胞周期及增加细胞增殖的能力。本研究主要探讨膀胱癌组织及膀胱癌细胞中FAT10和survivin的表达,分析两者表达水平之间的关系及其临床意义;研究FAT10通过调控survivin的表达对膀胱癌细胞增殖的影响及其具体机制。方法:1、选取随访5年以上资料完整的膀胱癌患者133例,免疫组化检测FAT10和survivin在膀胱癌组织石蜡块中的表达情况,分析FAT10和survivin表达的相关性、并分析其与患者的临床病理资料及预后的关系。2、收集50例膀胱癌患者的膀胱癌组织及癌旁组织,通过荧光定量PCR、Western blot检测膀胱癌组织和癌旁组织中FAT10和survivin的表达情况,并分析两者表达是否存在相关性。3、通过荧光定量PCR和Western blot检测膀胱癌细胞T24、J82、5637、UM-UC-3及正常细胞株人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1中FAT10和survivin的m RNA和蛋白表达情况。4、我们构建了4个sh FAT10干扰质粒,并将我们构建的4干扰质粒转染至膀胱癌细胞,利用荧光定量PCR和Western blot检测转染48h后FAT10的表达变化,筛选出sh FAT10最佳干扰质粒;将筛选出的最佳sh FAT10干扰质粒转染到膀胱癌5637细胞中,运用Western blot检测转染48h后细胞中FAT10和survivin蛋白表达变化,运用Ed U实验观察干扰FAT10后膀胱癌细胞增殖能力的变化;将过表达FAT10质粒转染到膀胱癌UM-UC-3细胞中,运用Western blot检测转染48h后细胞中FAT10和survivin蛋白表达变化,运用Ed U实验观察过表达FAT10后膀胱癌细胞增殖能力的变化;利用稳定转染sh FAT10的膀胱癌细胞株建立人膀胱癌裸鼠皮下瘤模型,观察裸鼠肿瘤的生长情况。5、我们构建了4个shsurvivin干扰质粒,并将我们构建的4个干扰质粒转染至膀胱癌细胞,利用荧光定量PCR和Western blot检测转染48h后survivin蛋白和m RNA的表达变化,筛选出shsurvivin最佳干扰质粒;在膀胱癌细胞中降低FAT10的同时增加survivin的表达及在膀胱癌细胞中增加FAT10的同时干扰survivin的表达,利用Ed U实验观察膀胱癌细胞增殖能力的变化。6、利用免疫共沉淀、激光共聚焦及体外泛素化实验等方法明确FAT10通过调控survivin的泛素化降解稳定survivin表达的具体机制。结果:1、免疫组化显示133例膀胱癌组织中FAT10的阳性率为52.6%,Survivin的阳性率为56.4%,且两者的表达呈正相关(P<0.001);荧光定量PCR及Western blot检测50例膀胱癌组织及癌旁组织中FAT10及survivin的表达,结果发现癌组织中FAT10和survivin m RNA及蛋白的表达明显高于癌旁组织(P<0.05),通过散点图分析发现FAT10与survivin呈正相关(p<0.05);通过荧光定量PCR和Western blot检测四株膀胱癌细胞和正常细胞株人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1中FAT10和survivin的表达情况,结果发现所有膀胱癌细胞株中的FAT10和survivin的表达明显高于正常细胞株人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1,且其表达趋势较一致;FAT10和survivin的表达与患者的肿瘤分期有关(P<0.05),FAT10阳性表达组和survivin阳性表达组患者的总生存期及无疾病生存期5年生存率低于阴性表达组,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);将患者FAT10和survivin的表达分为四类:FAT10(-)survivin(-),FAT10(+)survivin(-),FAT10(-)survivin(+),FAT10(+)survivin(+),结果显示FAT10(+)survivin(+)组对应的平均生存时间最短(P<0.05);多因素Cox回归分析显示肿瘤分级为影响预后独立的影响因素。2、稳定转染sh FAT10质粒的膀胱癌细胞5637中,FAT10蛋白表达明显下降(p<0.05),同时survivin蛋白的表达也随之减少(p<0.05),Ed U实验发现膀胱癌细胞5637中sh FAT10组的增殖能力比sh NC组明显降低(P<0.05);稳定转染过表达FAT10质粒的膀胱癌细胞UM-UC-3中,FAT10蛋白表达明显升高(p<0.05),同时survivin蛋白的表达也随之增加(p<0.05),Ed U实验发现过表达FAT10可以明显增加UM-UC-3细胞的增殖能力(P<0.05);利用人膀胱癌裸鼠皮下肿瘤模型发现sh FAT10组的裸鼠成瘤体积明显小于sh NC组,瘤体的重量也明显小于空载质粒对照组(p<0.05)。3、转染sh FAT10至5637细胞后发现survivin表达下降,而转染GV141-Survivin至稳定干扰FAT10的5637细胞中可以恢复survivin的表达,增殖能力明显升高;转染pc DNA3.1(-)myc-His-FAT10至UM-UC-3细胞后,Survivin表达升高,而转染shsurvivin至稳定高表达FAT10的UM-UC-3细胞中发现survivin的表达下降,且增殖能力明显下降。表明survivin是FAT10调节膀胱癌增殖的关键效应分子。4、免疫共沉淀及激光共聚焦发现survivin和Ub直接结合,在膀胱癌细胞中survivin蛋白经过泛素蛋白酶体降解;免疫共沉淀及激光共聚焦发现survivin和FAT10直接结合;FAT10稳定survivin是通过拮抗survivin的泛素化降解。结论:FAT10通过拮抗survivin泛素化降解从而稳定survivin的表达促进膀胱癌的增殖。