结核病（tuberculosis，TB）是由分枝杆菌属中的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，主要通过气溶胶形式在人群中传播。自上世纪九十年代以来，MTB耐药菌株的出现和增加、TB合并人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多、人口流动性增加，特别是目前唯一可用于预防TB的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG）对成人的保护效果欠佳等原因，使得TB疫情不能得到有效控制。因此，研制新的预防性或兼具治疗性的TB疫苗，是TB防治研究中的重要内容。目前TB的传播难以得到有效控制的主要原因有：1）MTB感染机体后，MTB特殊的脂质表面结构导致其可在巨噬细胞内长期存活，以持留菌的形式或潜伏状态存在，而感染者并不出现临床症状或症状轻微，这些潜伏感染者的发病是新增TB病例的主要来源；2）耐药菌株增加，尤其是多重耐药性MTB的出现和流行，使得原用于TB治疗的化学药物对耐药菌的作用甚微。因此，针对MTB耐药性以及持续性感染状态，研发新的TB预防和治疗制剂及药物、探索新的治疗措施和途径具有重要意义。分枝杆菌属中的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种能够快速生长的、非致病性的分枝杆菌，能够高效表达外源性基因，是TB新型疫苗研究的理想候选载体。抗原85B（Ag85B）和6kDa早期分泌靶抗原（6kDa early secretedantigen target，ESAT-6）均为MTB感染早期分泌表达的免疫优势抗原，以其为靶抗原单独或融合后构建的基因疫苗、亚单位疫苗和重组BCG等均能有效刺激机体产生特异性的抗MTB免疫应答。此外，国内外研究表明，MTB热休克蛋白65（heat shockprotein65，Hsp65）及辅助性T细胞1型（Th1）细胞因子——白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）也均能有效刺激机体产生对MTB的免疫应答。【研究目的】以MS为表达载体，构建能够分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组MS（rMS），观察rMS诱导小鼠特异性免疫应答尤其是细胞免疫应答的能力；评价其作为治疗性疫苗单独或与抗TB化学药物联合应用对MTB耐药株感染小鼠及MTB标准株低剂量感染小鼠的免疫治疗效果。【实验方法和研究结果】1.重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rMS）的构建及鉴定以MTB H37Rv株（标准株）基因组DNA为模版，多聚酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）扩增ag85B基因片段和携带疏水性氨基酸残基基因连接片段（linker）的esat-6基因片段。经T4连接酶连接后，PCR扩增获得融合基因ag85B-linker-esat-6。将融合基因克隆入pMD18-T载体后，再将其亚克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中，进行酶切鉴定和序列测定。结果显示，可切出预期大小片段，测序分析表明ag85B和esat-6基因与GenBank公布的序列完全一致，将其命名为pDE22-ag85B-esat-6。将pDE22-ag85b-esat-6电穿孔转化MS感受态细菌，提取质粒后采用酶切法进行基因型鉴定，结果证明切出的目的基因片段大小与预期一致。将基因型鉴定正确的rMS菌株经42℃热诱导表达后，SDS-PAGE分析并采用抗Ag85B的多克隆抗体和抗ESAT-6的单克隆抗体对表达产物进行Western blot鉴定。结果表明rMS菌可分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白，证明rMS构建成功，将其命名为Ag85B-ESAT-6-rMS。2. Ag85B-ESAT-6-rMS诱导小鼠的免疫应答方法：取6~8周龄雌性BALB/c小鼠75只，随机分成5组（每组15只），即Ag85B-ESAT-6-rMS组、BCG组、MS组、纯化的Ag85B-ESAT-6融合蛋白（AE）组及生理盐水对照组。rMS组和MS组分别经背部皮下注射相应细菌1×107CFU/只，间隔2周，共免疫3次；BCG组经背部皮下注射BCG1×107CFU/只，仅免疫1次；AE组经腹股沟皮下包埋含20μg AE的硝酸纤维素膜，间隔3周，共免疫2次。初次免疫后第1周起，每周采集各组小鼠尾静脉血（共采集6周），无菌分离外周血单核细胞（PBMC），分析CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比；初次免疫后第6周，乙醚麻醉后处死小鼠，无菌法取各组小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，分别检测其特异性增殖指数（SI）、CTL杀伤活性，以及分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的淋巴细胞频数。结果：①Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的PBMC中CD4+T细胞与CD8+T细胞所占百分比之和均高于其他各组（P<0.05）；②Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞SI高于生理盐水组、AE免疫组和MS免疫组（P<0.05），而与BCG免疫组相比无显著差异（P>0.05）；③Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞CTL杀伤效率高于生理盐水组和MS组（P<0.05），与AE免疫组和BCG免疫组比无显著差异（P>0.05）；④Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的细胞频数分别高于其他各组（P<0.05），分泌IL-4的细胞频数与BCG免疫组和MS免疫组相比无显著差异（P>0.05）。以上结果表明，Ag85B-ESAT-6-rMS可诱导小鼠强烈的免疫应答，并以Th1型细胞免疫应答为主。3. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB耐利福平株感染小鼠模型的免疫治疗方法：①取MTB耐利福平（Rifampin，RFP）株经尾静脉注射感染6~8周龄的雌性BALB/c小鼠（1×106CFU/只），感染后第4周，无菌分离小鼠脾脏和肺脏，制作组织切片，进行HE染色观察和抗酸染色检查，平板计数法分别检测两脏器的荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB耐RFP株感染小鼠，并将感染小鼠随机分为8组（15只/组），即异烟肼（Isoniazid，INH）治疗组、RFP治疗组、Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、 Hsp65-IL-2-rMS治疗组、 INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、INH+Hsp65-IL-2-rMS联合治疗组、 MS治疗组、生理盐水对照组。其中Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组和MS组分别在感染后6周和10周经小鼠背部皮下注射1×107CFU的rMS或MS；联合治疗组在感染后第6周开始用INH给小鼠灌胃治疗，持续4周，第10周时再经小鼠背部皮下分别注射1×107CFU的两种rMS；RFP组和INH组自感染后第6周开始灌胃治疗，持续8周。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；在治疗后第4周和第8周，分别无菌分离小鼠脾脏和肺脏，同上进行抗酸染色检查、HE染色观察，并进行荷菌数检测。④治疗后统计各组小鼠存活率。结果：①感染小鼠模型肺和脾中均可见抗酸杆菌（+++），HE染色可见慢性肉芽肿性炎的表现，肺和脾荷菌数分别达105和104CFU，表明MTB耐RFP株感染小鼠模型建立成功；②生理盐水组、RFP组和MS组的小鼠体重均呈下降趋势，INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组、Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组的小鼠体重均呈显著增长趋势（P<0.05）；③治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织中抗酸染色镜检的结果显示，生理盐水组和RFP组均呈强阳性（++++或+++），其次为MS组（+++），而Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组为（++），INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组均为（+）；④治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示，各组小鼠肺组织均呈慢性炎症反应，除INH组外其他各组均呈慢性肉芽肿性炎的表现，肺间质增生并纤维化，表明MS和rMS可引起小鼠肺组织一定程度的病理损伤；⑤治疗后第4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组、INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组小鼠脾和肺的荷菌数（log10CFU）均低于生理盐水对照组（P<0.05），表明两种rMS均能有效抑制MTB耐RFP株在小鼠组织中的增殖，具有免疫治疗作用，与INH联合应用时的治疗效果较单独用rMS的治疗效果更好；⑥rMS与INH联合治疗组小鼠存活率均高于rMS单独治疗组和MS组，但是与生理盐水对照组无差别，结果提示各组存活率排序除与小鼠MTB脏器荷菌数的多少有关之外，还与小鼠肺组织显示的病理损伤（间质增生并纤维化）程度一致。4. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗方法：①取MTB H37Rv株经尾静脉注射感染6~8周龄的雌性C57BL/6小鼠（1×104CFU/只），分别于感染第6周和第10周时，无菌分离小鼠脾和肺脏，制作组织切片进行抗酸染色检查和HE染色观察，平板计数法计脏器荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB H37Rv株感染小鼠，并将其随机分为4组（30只/组），即Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、RFP/INH治疗组和感染模型对照组；各组治疗均在感染后第10周开始，其中Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组经背部皮下注射1×107CFU/只，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组先用RFP/INH通过饮水治疗4周后，再用Ag85B-ESAT-6-rMS通过皮下注射治疗，剂量同上，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH药物治疗组通过饮水治疗，持续12周；各组小鼠在治疗结束4周后，通过肌肉注射地塞米松诱导小鼠MTB感染的复发。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；分别在实验开始后第8周、13周、17周、22周和26周无菌分离小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，采用ELISpot检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数；④分别在第10周、14周、18周、22周和第26周无菌分离小鼠肺、脾组织，进行抗酸染色检查、HE染色观察及荷菌数（CFU）检测。结果：①感染小鼠肺和脾中均可见抗酸杆菌（++），HE染色可见慢性炎症反应（无典型慢性肉芽肿性炎的病理表现），肺和脾荷菌数分别为104CFU和103CFU，表明MTB低剂量感染小鼠模型建立成功；②各组小鼠体重均呈缓慢增长趋势，各组间无显著差异（P>0.05）；③在各自的免疫治疗后的4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数均高于感染模型对照组（P<0.05）；④治疗后各组小鼠肺组织的HE染色观察均可见轻至中度慢性炎症反应，未见明显的病理性损伤表现。⑤治疗后，Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠的肺、脾荷菌数均低于感染模型对照组（P<0.05），其中联合治疗组的效果更为显著；地塞米松诱导后，该两组小鼠肺、脾荷菌数虽然上升，但仍低于感染模型对照组（P<0.05）。【结论】本研究成功构建了能分泌表达MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白的Ag85B-ESAT-6-rMS，该菌能够诱导免疫小鼠以Th1型为主的细胞免疫应答。Ag85B-ESAT-6-rMS能够抑制MTB耐RFP株在小鼠肺和脾组织中的增殖，对该菌株感染小鼠具有明显的免疫治疗作用，但同时也可引起感染小鼠肺组织一定的病理损伤；将Ag85B-ESAT-6-rMS与INH联合应用时的治疗效果显著优于单独用rMS治疗。Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠也有明显的免疫治疗作用；与RFP和INH联合治疗的效果要优于单独使用rMS；Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗后，小鼠肺组织未见明显病理损伤。Ag85B-ESAT-6-rMS作为治疗性疫苗有一定的优势，主要针对一些耐药菌或是残留于组织和细胞中低载量的休眠菌引发免疫清除，利用其可调节机体免疫系统功能，增强机体特异性免疫应答的特性，与化疗药物联用，发挥协同治疗作用。