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马立克病(Marek’s Disease,MD)是由马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的严重危害世界家禽养殖业的疾病,该病主要临床症状为被感染鸡只麻痹、眼盲、淋巴瘤形成以及免疫抑制。MDV属于疱疹病毒目、疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、马立克病毒属的双链线性DNA病毒。MD是最早能够用抗病毒疫苗防治病毒诱导的肿瘤病,是研究病毒诱导肿瘤的重要模型。近年来,MDV毒力的不断增强,免疫失败的例子时常发生,而且毒力的进化很可能由疫苗本身驱动。高毒力MDV毒株引起的MD爆发可能是家禽养殖业的巨大威胁。MicroRNA是内源性的、长度约20-24碱基的非编码RNA,它们通过后转录机制调节基因表达及细胞分化、发育、增殖和凋亡等多种生物过程。MDV1基因组编码26个成熟microRNA,研究表明一些microRNA在MDV1致病过程发挥重要作用,其中miR-M4-5p是miR-155的病毒模拟物。研究发现miR-M4-5p可能直接参与MD淋巴瘤形成。因此,对miR-M4-5p调控MDV致病机理的研究有助于加深对MD分子机制,尤其是肿瘤发生机制的理解。1、MDV超强毒株GX0101感染后鸡脾脏动态转录组的研究为了解MDV感染后宿主基因的动态变化,本研究以MDV超强毒株GX0101感染后3、7、14、21、30和60天的脾脏为研究对象。提取实验组及对照组脾脏样品RNA并进行质量检测,结果显示RNA样品质量符合RNA-seq建库要求,能够用于转录组测序。RNA-seq完成后,对原始数据进行数据过滤后获得高质量数据;各个文库89%以上的clean reads能比对到参考基因组上。对基因表达量进行分析,在GX0101感染后3、7、14、21、30和60天分别获得1,567、1,342、2,503、3,517、3,810和1,351个差异表达基因,其中上调基因分别有736、812、1,507、2,250、2,390和571个;下调基因分别有831、530、996、1,267、1,420和780个。12个宿主基因qRT-PCR检测结果与RNA-seq结果一致,进一步证明RNA测序结果的真实性和可靠性。差异基因功能分析发现:先天免疫反应和炎症反应在早期溶细胞期建立,持续到淋巴瘤形成阶段;体液免疫在后期溶细胞期,且最先在肠道系统中发挥作用;在细胞增殖阶段,与转录和翻译相关的信号通路被显著富集。本研究为进一步了解马立克病发病机理提供了数据支撑;同时,分析获得的GX0101感染导致的下调基因为miR-M4-5p提供了候选基因库。2、miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1细胞的增殖在本研究中,利用生物信息学软件对测序获得的下调基因库基因进行预测,筛选获得7个miR-M4-5p的假定靶标,分别为早期生长反应蛋白1(EGR1)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白1(FN1)、免疫球蛋白J链(IGJ)、核不均一核糖核蛋白AB(hnRNPAB)、蛋白酪氨酸磷酸酶5(PTPN5)和胶原蛋白XII型(COL12A)。利用双荧光素酶报告实验检测miR-M4-5p对各基因的抑制效果,结果发现hnRNPAB-3’UTR荧光素酶活性被抑制,且抑制效应具有靶标位点以及种子序列特异性。在过表达miR-M4-5p或GX0101感染的CEF细胞中,q RT-PCR和Western blot检测结果均发现hnRNPAB表达量被降低,证明hnRNPAB是miR-M4-5p的靶标。为研究miR-M4-5p和hnRNPAB对细胞功能的影响,过表达miR-M4-5p或特异性沉默hnRNPAB表达,结果发现CEF和DF-1细胞的细胞活性增强,细胞凋亡不受影响。本研究阐明miR-M4-5p靶向hnRNPAB调控细胞增殖是调控肿瘤的方式之一。3、鸡hnRNPAB单克隆抗体的制备及应用由于商品化hnRNPAB多克隆或单克隆抗体不能识别鸡hnRNPAB蛋白,hnRNPAB蛋白水平的研究被限制,因此,需要自制鸡hnRNPAB抗体。构建的三种重组蛋白pET28a-hnRNPAB、pET30a-hnRNPAB和pET32a-hnRNPAB均正常表达,且都引起小鼠的免疫反应。其中,pET30a-hnRNPAB蛋白以可溶状态表达,并且该蛋白的小鼠免疫效果最好。经融合、鉴定筛选获得单克隆抗体5H5-H1和5H5-G2,它们的效价为8.19×10~5。Western blot结果证实其均能特异性结合鸡hnRNPAB蛋白。同时,制备的单克隆抗体还能用于多种哺乳动物源hnRNPAB蛋白的免疫荧光检测实验。本研究为进一步研究鸡hnRNPAB蛋白生物学功能提供了必备材料。