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[研究背景和目的]肿瘤复发及转移是一个多步骤、多因素、序贯的复杂过程。首先,肿瘤原发灶的肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT),使其更容易从原发灶脱落下来,进入血循环形成循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs),然而大部分CTCs在血液系统中发生凋亡,仅有少部分能抵抗失巢凋亡而存活下来,发生EMT的逆向过程即间质上皮转化(Mesenchymal-Epithelial Transition,MET),并最终定植于实质脏器形成复发灶或转移灶。近年来研究显示,趋化因子配体8 (Chemokine Ligand 8,CXCL8),又称为IL-8,与多种肿瘤的发生发展相关,其中与结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)及其复发、转移的关系尤为密切。CXCL8是人们发现的第一个趋化因子,也是第一个被发现具有血管生成效应的趋化因子,主要通过结合受体CXCR1、CXCR2而产生相应的生物学效应。CXCR1/2均是七次跨膜G蛋白偶联受体,二者约80%为同源序列,是CXCL8发挥效应的主要受体,不仅可以促进肠癌细胞的生长、增殖,还可以诱导肠癌细胞发生EMT、抵抗失巢凋亡、促进血管生成等。尽管已有大多数临床资料研究以及基础研究均表明CXCL8及其受体在肠癌复发及其远处转移过程中起着促进作用,同时我们课题组前期研究已经证实CXCL8在诱导肠癌细胞EMT及抵抗失巢凋亡方面的作用。然而,CXCL8及其受体在诱导CTCs形成之后向实质器官的“信号归巢”机制还不是很清楚。本研究旨在建立免疫磁珠阴性分选联合四色免疫荧光染色的技术,并将其用于结直肠癌患者外周血CTCs的富集、鉴定及其表面分子CXCR1/2的检测。根据CTCs阳性检出情况及CTCs表达CXCR1/2的情况,我们可以分析其与肠癌患者临床参数及早期预后的相关性,评估其作为肠癌患者临床预后因子的可行性,同时创建一种用于患者分层的筛查方法,为建立降低CRC复发及转移的新策略提供新的思路。[方法]1、采用Western Blot、流式细胞术以及细胞爬片免疫荧光的方法检测CXCR1/2在不同肠癌细胞系中的表达情况,并筛选出CXCR1/2高表达与低表达的肠癌细胞系,用于后续实验的研究。2、通过向健康志愿者外周血中掺入一定数目的肠癌细胞,根据回收率情况确定分选、鉴定肠癌CTCs及CTCs表达CXCR1/2情况的具体方法。采用Ficoll-Paque PLUS液密度梯度分离法+磁性激活细胞分选技术(Magnetic Activated Cell Separation, MACS)去除分选法,分离外周血中掺入了肠癌细胞的单个核细胞层。(1)洗涤干净后对其进行四色免疫荧光染色实验,在荧光显微镜下观察并记录肠癌细胞的回收率情况。(2)回收率达到70%以上时确立具体方案,并将其用于临床血样的检测。3、对22例正常人、18例肠息肉患者和129例结直肠癌患者进行CTCs的检测与鉴定,根据不同受检者CTCs检出情况对肠癌患者CTCs阳性进行定义。4、根据129例结直肠癌患者外周血循环CTCs的检出情况及CTCs表达CXCR1/2的情况,对患者进行分组,研究不同分组情况下各临床病理因素在肠癌患者早期预后中的意义。[实验结果]1、SW480细胞系和Lovo细胞系被筛选用于细胞掺入CTCs模型的建立。2、我们建立的CTCs分离、鉴定技术能够在各个细胞数掺入水平均回收到70%以上的肿瘤细胞,方法可行。回收到的SW480细胞和Lovo细胞中均部分呈现 CK+/CD45-/DAPI+/CXCR1/2+表型,部分呈现 CK+/CD45-/DAPI+/CXCR1/2-表型,但SW480细胞以CXCR1/2-表型多见,而Lovo细胞则以CXCR1/2+表型多见。3、在22例正常人中,有7例检出CTCs,15例未检出,CTCs检出范围0～2个,平均检出数0.5 ± 0.7个;在18例肠息肉患者中,有12例检出CTCs, 6例未检出,CTCs检出范围0～23个,平均检出数4.9 ±7.5个;在129例始发的结直肠癌患者中,118例患者于外周血中检出CTCs,11例未检出,CTCs检出范围0～84个,平均检出数22.7±20个。4、在CTCs数目Cutoff值分别定为>0、>1、>2个/ 5 mL时,不同受检者(正常人、肠息肉患者、结直肠癌患者)CTCs阳性检出率均随着疾病的严重程度加重而增加。当Cutoff值为>2时,正常人的CTCs阳性率为0,肠息肉患者和结直肠癌患者CTCs对应的阳性率分别为33%和79.8%。于是将CTCs数目>2个的结直肠癌患者记为CTCs阳性(103例),否则记为CTCs阴性(26例)。对于CTCs阳性的患者,若阳性表达CXCR1/2的CTCs数目≥50%,则称为CTCCXCR1/2高表达者,否则称为CTCCXCR1/2低表达者。对所有肠癌患者进行定期随访,其中有30例患者发生早期复发/转移,99例没有发生早期复发/转移,早期复发/转移率23%。5、四格表χ2检验显示CTCs阳性检出与患者早期复发/转移情况相关(χ2 =4.419,P=0.039),但单因素和多因素COX回归分析结果显示:只有术前血清癌胚抗原(Carcino-Embryonic Antigen,CEA)水平(HR = 2.189,P = 0.044)、临床分期(HR = 3.165,P=0.005)、有无淋巴结转移(HR = 4.557,P=0.002)这三个因素是影响患者早期复发/转移的危险因素,CTCs阳性检出与否并非肠癌患者早期预后的独立危险因素。6、对于CTCs阳性的103例肠癌患者,CTCCXCR1/2表达情况与患者肿瘤大小(χ2 = 7.663,P=0.009)、肿瘤分级(χ2 = 7.174,P=0.009)、有无淋巴结转移(χ2 = 5.598, P= 0.028)以及早期复发/转移(χ2= 29.051, P<0.001)等相关。而单因素和多因素COX回归分析结果显示:术前CTCCXCR1/2表达情况(HR= 3.667,P=0.022)、临床分期(HR = 2.688,P= 0.023)、有无淋巴结转移(HR= 3.428, P = 0.028)这三个因素是影响患者早期复发/转移的危险因素,且其对应的危险系数从前至后依次降低。7、将129例患者分为循环肠癌细胞CXCR1/2高表达组(即CTCCXR1/2高表达者)与循环肠癌细胞CXCR1/2低/不表达组(包括CTCCXCR1/2低表达者以及CTCs阴性者),单因素及多因素COX回归分析显示,循环肠癌细胞CXCR1/2表达情况(HR = 3.522,P=0.011 )、临床分期(HR = 2.256,P=0.046)、有无淋巴结转移(HR=3.533, P = 0.013)这三个因素是影响患者早期复发/转移的危险因素。因此,循环肠癌细胞CXCR1/2的高表达是肠癌患者早期预后的独立危险因素。8、Kaplan-Meier生存分析结果显示,肠癌患者CTCs是否阳性与其早期生存之间无明显统计学差异(Log Rank = 2.977,P=0.088 ); CTCs表达CXCR1/2情况与CTCs阳性肠癌患者早期生存之间有明显统计学差异,与CTCCXCR1/2高表达者相比,CTCCXCR1/2低表达者无瘤生存时间明显延长(Log Rank = 20.420, P <0.01 );循环肠癌细胞CXCR1/2表达情况与肠癌患者早期生存之间有明显统计学差异(Log Rank = 26.622,P< 0.01 ),与CTCCXCR1/2低/不表达组相比,高表达组无瘤生存时间较后者明显延长。[结论]1、本研究建立的免疫磁珠阴性分选以及DAPI/CK/CD45/CXCR1/2四色免疫荧光染色方法,可用于肠癌CTCs的CXCR1/2表型鉴定。2、根据CTCs表达CXCRR1/2情况可以对肠癌患者进行分层,评估患者早期复发/转移的风险。靶向CXCL8-CXCR1/2信号轴有望成为肠癌治疗新策略。