艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的简称,是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的。HIV主要侵犯、破坏CD4+淋巴细胞,使机体细胞免疫功能受损,最终并发各种严重的机会性感染和肿瘤而导致死亡。1981年,美国发现了1例原因不明的咽喉部严重霉菌感染、体重减轻显著的患者,经多方治疗无效后死亡。后证实其为首例AIDS患者。1982年9月美国疾病控制中心(CDC)正式以“获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)”为该病命名。CD4淋巴细胞是HIV感染的靶细胞。HIV复制的数量越多,破坏的CD4细胞越多,余留的CD4细胞就越少,患者的免疫力就越差。CD4细胞计数与HIV载量两者均可以独立地预测HIV感染者的临床进程和生存期,广泛用于评估HIV感染的进程、监测抗病毒治疗期间病毒血症的变化。口腔念珠菌病是HIV感染者的常见并发症,多数学者认为口腔念珠菌病的出现是免疫抑制的先兆,预示疾病即将从HIV感染进入到AIDS阶段,是早期发现和诊断AIDS的重要线索。在HIV感染者病情发展过程中口腔念珠菌病发生率高达90%。其中白色念珠菌是最常见的分离株。然而,由于免疫抑制治疗药物和广谱抗真菌剂的普遍应用,光滑念珠菌引起的黏膜和系统性感染的发生率明显增多,已成为继白色念珠菌之后,首位最常见的导致念珠菌病的菌种。Polishchuk等1994-2005年检测乌克兰HIV感染者分离的酵母样菌,发现非白色念珠菌增加到46.2%,光滑念珠菌(21.3%)为优势菌种。在以往研究中,我们收集了82例HIV感染者的口腔含漱液,有60例培养出念珠菌,其中有42例可分离出白色念珠菌,44例可分离出光滑念珠菌,同时分离出白色念珠菌和光滑念珠菌的有29例。由此可见,在HIV感染者中,除了主要的白色念珠菌外,光滑念珠菌的检出率也在增高,且可以单独存在,也可与白色念珠菌混合存在。过去多数研究认为1个个体仅有1种菌株感染,随着念珠菌培养技术的提高,可同时快速鉴定不同菌种,证实混合感染的存在。周菊芬等调查80名正常人群和109例口腔念珠菌病患者口腔念珠菌情况,发现正常人群混合带菌率达11.3%,口腔念珠菌病患者为20.8%。Li等认为白色念珠菌和光滑念珠菌共同导致的感染比单独由白色念珠菌引起的感染更不容易治愈。同样Redding等也发现HIV感染者和癌症患者的白色念珠菌混合光滑念珠菌感染的相关口咽念珠菌病比白色念珠菌单独导致的感染更严重和更难治疗。HIV感染者易感染口腔念珠菌病的机制较复杂,除宿主免疫因素外,念珠菌本身的毒力变化也可能参与致病过程。与念珠菌相关的毒力因素主要有粘附性、侵袭性的酶、溶血性、形态发生和表型转换等。念珠菌通过粘附来识别定植；通过其利于侵入的侵袭性酶而破坏黏膜完整性,增强毒力；通过溶血性获得营养；通过形态发生及酵母相和菌丝相之间的转换而使其利于侵入宿主,并对该微生物的适应性有利。HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌混合感染导致的口咽念珠菌病更难治是否与念珠菌的毒力有关值得关注。此外,从细菌在宿主定植的机制上看,宿主的免疫状况和细菌的毒力亦密切相关。而光滑念珠菌的检出率逐渐增加是否与它的毒力增强相关,它是否具有比白色念珠菌更强的致病力,这也是本实验关注的问题。因此本文从是否混合感染和CD4细胞计数这两个因素出发,选取HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌各40株,研究并比较其对颊黏膜上皮细胞(Human buccal epithelial cells,BECs)的粘附性、体外磷脂酶活性和溶血性,来探讨其毒力的变化规律。复苏冻存的HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株,从感染类型和CD4细胞计数两因素研究并比较其对BECs的粘附性、体外磷脂酶活性和溶血性,探讨不同菌种、机体免疫力、感染类型与念珠菌毒力之间的关系。从冻存的菌株中挑选白色念珠菌40株。单一白色念珠菌感染的20株为单一感染组,其中CD4细胞计数>200个/mm3的菌株10株,CD4细胞计数<200个/mm3的菌株10株；与光滑念珠菌混合感染的20株为混合感染组,其中CD4细胞计数>200个/mm3的菌株10株,CD4细胞计数<200个/mm3的菌株10株。从冻存的菌株中挑选光滑念珠菌40株。单一光滑念珠菌感染的20株为单一感染组,其中CD4细胞计数>200个/mm3的菌株10株,CD4细胞计数<200个/mm3的菌株10株；与白色念珠菌混合感染的20株为混合感染组,其中CD4细胞计数>200个/mm3的菌株10株,CD4细胞计数<200个/mm3的菌株10株。将-70℃保存的HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株复苏,并接种到沙保琼脂培养基上,37℃培养18-24 h。0.5 ml菌悬液和0.5 ml BECs液混匀,37℃水浴振荡1 h,12μm的微孔滤膜过滤,PBS冲洗,置于载玻片上晾干,进行革兰氏染色。计算每100个BECs上粘附的念珠菌个数,用H值表示。将10μl菌悬液滴于蛋黄培养基表面,37℃培养48 h后观察结果。磷脂酶阳性的菌株在蛋黄培养基上的菌落周围会形成一个与菌落同圆心的沉淀圈(环),测定菌落直径和总直径(菌落+沉淀圈)。用Pz值表示磷脂酶的活力,Pz值=菌落直径／总直径。将10μl菌悬液滴于羊血培养基上,37℃、5% CO2培养48 h。溶血性阳性的菌株,在透射光下观察菌落周围,可观察到半透明的与菌落同圆心的溶血环,测定菌落直径和总直径(菌落+溶血环)并计算溶血指数：溶血指数=菌落直径/总直径。白色念珠菌粘附性结果：经析因方差分析结果显示是否混合感染和CD4细胞计数两因素间无交互作用(F=1.990,P=0.167),只需分析主效应。单一感染组和混合感染组对BECs的粘附性差异有统计学意义,白色念珠菌混合感染组比单一感染组粘附性强(F=14.939,P=0.000)；不同CD4水平间差异无统计学意义(F=0.336,P=0.566)。光滑念珠菌粘附性结果：经析因方差分析结果显示是否混合感染和CD4细胞计数两因素间无交互作用(F=0.758,P=0.390),只需分析主效应。单一感染组和混合感染组对BECs的粘附性差异有统计学意义,光滑念珠菌混合感染组比单一感染组粘附性强(F=10.112,P=0.003)；不同CD4水平间差异有统计学意义,CD4细胞计数低组比CD4细胞计数高组粘附性强(F=5.031,P=0.031)。白色念珠菌和光滑念珠菌对BECs的粘附性比较结果：当感染类型为单一感染时,存在交互效应(F=7.092,P=0.012),需分析单独效应。CD4细胞计数不同水平上,光滑念珠菌的粘附性均高于白色念珠菌(P<0.05)；当感染类型为混合感染时,两因素间无交互效应(F--0.042,P=0.840),光滑念珠菌的粘附性高于白色念株菌(F=5.661,P=0.023)；当CD4细胞计数>200个/mm3时,两因素间无交互效应(F=1.390,P=0.246),光滑念珠菌的粘附性高于白色念株菌(F=7.614,P=0.009)。当CD4细胞计数<200个/mm3时,两因素间无交互效应(F=1.286,P=0.264),光滑念珠菌粘附性高于白色念株菌(F=11.167,P=0.002)。总之无论是单一感染还是混合感染,无论是CD4细胞计数>200个/mm3还是CD4细胞计数<200个/mm3,光滑念珠菌对BECs的粘附性均高于白色念珠菌。白色念珠菌体外磷脂酶活性：40株白色念珠菌均为磷脂酶阳性。经析因方差分析,结果显示是否混合感染和CD4细胞计数两因素之间无交互作用(F=0.823,P=0.370),只需分析主效应。白色念珠菌单一感染组和混合感染组磷脂酶活性差异有统计学意义(F=6.319,P=0.017),白色念珠菌混合感染组比单一感染组磷脂酶活性高；不同CD4水平间差异无统计学意义(F=0.440,P=0.512)。光滑念珠菌体外磷脂酶活性：40株光滑念珠菌均为磷脂酶阳性。是否混合感染和CD4细胞计数这两因素之间存在交互效应(F=38.841,P=0.000),需进行单独效应分析。当感染类型为单一感染时,显示CD4不同水平间无差异(t=1.292,P=0.213),感染类型为混合时,CD4细胞计数低组磷脂酶活性显著高于CD4细胞计数高组(t=8.715,P=0.000)；当CD4细胞计数高时,不同感染类型间无差异(t=0.526,P=0.605),当CD4细胞计数低时,混合感染组磷脂酶活性显著高于单纯感染组(t=11.379,P=0.000)。白色念珠菌与光滑念珠菌磷脂酶活性比较结果：当感染类型为单一感染时,菌种和CD4细胞计数水平之间不存在交互效应(F=1.251,P=0.271),光滑念珠菌的磷脂酶活性高于白色念珠菌(F=6.268,P=0.017)；当为混合感染时,存在交互效应(F--13.708,P=0.001),需分析单独效应,不同CD4细胞计数水平上,高时,白色念珠菌和光滑念珠菌体外磷脂酶活性无差异(t=-1.182,P=0.261)低时,光滑念珠菌的磷脂酶活性高于白色念珠菌(t=4.308,P=0.001)；当CD4细胞计数>200个/mm3时,存在交互效应(F=4.759,P=0.036),需分析单独效应。不同感染类型,白色念珠菌和光滑念珠菌的磷脂酶活性均无差异(P>0.05)；CD4细胞计数<200个/mm3时,存在交互效应(F=10.703,P=0.002),需分析单独效应。不同感染类型,单一感染时,光滑念珠菌和白色念珠菌的磷脂酶活性无统计学意义(t=1.372,P=0.187),混合感染时,光滑念珠菌磷脂酶活性高于白色念珠菌(t=4.308,P=0.001)。白色念珠菌溶血性结果：40株白色念珠菌均为溶血性阳性,且均有alpha溶血和beta溶血。经析因方差分析,结果显示是否混合感染和CD4细胞计数这两因素之间无交互效应(F=2.435,P=0.127),只需分析主效应。不同感染类型间白色念珠菌的溶血活性无统计学意义(F=0.021,P=0.886)；不同CD4细胞计数水平间无统计学意义(F=0.408,P=0.527)。光滑念珠菌溶血性结果：40株光滑念珠菌均为溶血性阳性,且均有alpha溶血和beta溶血。经析因方差分析,结果显示是否混合感染和CD4细胞计数这两因素之间无交互效应(F=0.124,P=0.727),只需分析主效应。不同感染类型间光滑念珠菌的溶血活性无统计学意义(F=0.007,P=0.934)；不同CD4水平间无统计学意义(F=0.194,P=0.662)。白色念珠菌和光滑念珠菌的溶血性比较结果：当单一感染时,无交互效应(F--0.095,P=0.759),光滑念珠菌的溶血性高于白色念珠菌(F=l 1.921,P=0.001)；当混合感染时,无交互效应(F=1.816,P=0.186),光滑念珠菌的溶血性高于白色念珠菌(F=11.994,P=0.001)；CD4细胞计数>200个/mm3时,无交互效应(F=0.532,P=0.471),光滑念珠菌的溶血性高于白色念珠菌(F=8.520,P=0.006)；CD4细胞计数<200个/mm3时,无交互效应(F=0.920,P=0.344),光滑念珠菌的溶血性高于白色念珠菌(F=15.925,P=0.000)。总之,无论是单一感染还是混合感染,无论是CD4细胞计数>200个/mm3还是CD4细胞计数<200个/mm3,光滑念珠菌的溶血性均高于白色念珠菌。1.在HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌混合感染时,菌株的磷脂酶和粘附性比在单一感染时要高,说明混合感染时的菌株毒力比单一感染时高,这可能是混合感染时念珠菌病更难治疗的原因之一。2.与白色念珠菌相比,HIV感染者口腔光滑念珠菌分离株的粘附性、磷脂酶活性和溶血性均较高,说明光滑念珠菌的毒力比白色念珠菌高,这可能也是白色念珠菌与光滑念珠菌混合感染所致的口咽念珠菌病比单一白色念珠菌感染更难治疗的另一原因。3.白色念珠菌和光滑念珠菌三种毒力因素的结果分别不同,两菌种毒力比较的结果也有所不同,这说明粘附性、磷脂酶活性和溶血性是相互独立的。且从结果提示,在念珠菌粘附定植、侵入并进入组织深部过程中,菌株内部和菌种之间的竞争可能逐渐趋于缓和。