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背景:新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是由于缺血缺氧引起的部分或完全脑血流减少最终导致脑损伤的一种疾病,是新生儿发病率和死亡率的主要原因。目前,治疗性低温（therapeutic hypothermia,TH）是唯一批准用于治疗新生儿缺血缺氧性脑病的干预措施,但TH的治疗窗口狭窄（出生后6 h内）且疗效不完全。我们迫切需要找到替代疗法。染料木素磺酸钠（genistein sodium sulfonate,GSS）是从染料木素磺化后的结构产物,具有水溶性好和生物利用度高的特点。我们的前期研究表明GSS在t MCAO模型中有良好的神经保护作用,但在HIE模型中的作用尚不清楚。代谢组学具有优于传统的单个代谢物测量方法的显著优势,可以同时评估围产期窒息后发生的缺氧缺血等大规模事件中的各种代谢途径。转录组学是基因功能与结构研究的基础,对理解生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。因此,我们借助于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱成像技术（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry imaging,MALDI-TOF MSI）,构建GSS治疗新生大鼠脑缺血缺氧后的MSI图谱,探明GSS对ATP代谢、TCA循环、金属离子、抗氧化剂和脂质代谢相关代谢产物在空间上的变化和影响。并利用RNA-Seq技术研究GSS对新生大鼠脑缺血缺氧后的基因表达变化,系统地揭示其药物作用的机制及其治疗靶点。目的:1.观察GSS对HIE新生大鼠脑梗死面积、神经功能和神经元丢失和退行性变的影响,明确GSS对HIE新生大鼠脑损伤的脑保护作用,并筛选出GSS脑保护作用的最佳剂量;2.借助MALDI-TOF质谱成像技术,探明GSS对新生大鼠缺血缺氧后ATP代谢、TCA循环和脂质代谢等相关代谢产物,以及金属离子和抗氧化物质的变化。3.利用RNA-Seq筛选GSS对新生大鼠缺血缺氧后大脑皮层的差异表达基因,进行GO和KEGG功能富集分析,并对差异表达基因进行验证。方法:1.采用Rice-Vannucci法建立新生SD大鼠HIE模型;2.用TTC染色测定脑梗死面积,并筛选出GSS治疗的最佳剂量;3.用Nissl染色观察GSS对HIE新生大鼠大脑皮层细胞形态学的改变;4.采用翻正反射、悬崖回避实验、负向趋地实验和前肢悬吊实验评估GSS对新生大鼠缺血缺氧后神经功能的改善作用;5.采用Neu N免疫荧光和Flouro-Jade C染色分别检测新生大鼠缺血缺氧后大脑皮层神经元的缺失和退行性变,观察GSS对神经元的保护作用;6.利用MALDI-TOF质谱成像技术,构建GSS治疗新生大鼠脑缺血缺氧后MSI图谱;7.利用RNA-Seq方法获得Sham、HI和GSS三个组脑组织皮层的基因表达谱,筛选出HI vs Shamup与GSS vs HIdown组合以及HI vs Shamdown与GSS vs HIup组合交叉的差异表达基因后,应用cluster Profiler软件分别对上调和下调DEGs进行GO和KEGG功能富集分析;8.用Western blot验证RNA-Seq鉴定出来的DEGs。结果:1.GSS对HIE新生大鼠具有脑保护作用。1.1 GSS治疗降低HIE新生大鼠的脑损伤并改善神经功能。为了探讨GSS对新生儿缺血缺氧性脑病的脑保护作用的最佳剂量,我们采用0.1 mg/kg、0.3 mg/kg和1 mg/kg三种剂量。TTC染色结果显示,1 mg/kg的GSS具有最显著的治疗效果;Nissl染色结果表明,与Sham组相比,HI组脑组织中细胞染色较浅,尼氏小体相对减少,神经元细胞发生肿胀,出现空泡状,轮廓不清晰,与HI组相比,GSS治疗组中尼氏小体相对增多,神经元细胞的分布及形态结构正常;翻正反射和前肢悬吊实验结果表明,新生大鼠的翻正和掉落时间没有统计学差异;在悬崖回避和负向趋地实验中,与Sham组相比,HI组所需时间明显增加,而GSS治疗后可显著减少所需时间。1.2 GSS治疗抑制HIE新生大鼠神经元的丢失和退行性变。Neu N免疫荧光结果表明,与Sham组相比,HI组Neu N的数量和荧光强度明显降低,神经元丢失严重,而GSS治疗可显著抑制HI组神经元的丢失;FJC染色结果显示,与Sham组相比,HI组FJC阳性细胞显著增多,大部分神经元出现退行性变,而GSS治疗可显著抑制神经元的退行性变。2.借助MALDI-TOF质谱成像技术探明GSS对新生大鼠脑缺血缺氧后能量代谢的影响。以1,5-DAN为基质,借助MALDI-TOF质谱成像技术,构建GSS对新生大鼠缺血缺氧后ATP代谢、TCA循环和脂质代谢等相关代谢产物,以及金属离子和抗氧化物质的MSI图谱。结果表明,GSS可以增强新生大鼠脑缺血缺氧后ATP的代谢,维持金属离子的稳定,增加抗氧化剂的含量并调节脂质的代谢来发挥脑保护作用。3.RNA-Seq结果表明GSS可能通过多基因、多蛋白以及多条通路对新生大鼠脑缺血缺氧发挥保护作用。与Sham组相比,HI组共鉴定出2782个DEGs,其中1360个基因上调,1422个基因下调,与HI组相比,GSS组共鉴定出2170个DEGs,其中1102个基因上调,1068个基因下调;筛选出HI vs Shamup与GSS vs HIdown组合交叉的586个DEGs,以及HI vs Shamdown与GSS vs HIup组合交叉的448个DEGs,表明GSS治疗分别下调586个DEGs和上调448个DEGs;GO富集分析显示,共有1087个GO-terms和603个GO-terms分别显着富集594个下调DEGs和471个上调DEGs;KEGG富集分析显示,共有60条通路和33条通路分别富集594个下调DEGs和471个上调DEGs。此外,WB验证结果与RNA-Seq结果一致。结论:1.GSS显著降低HIE新生大鼠的脑梗死面积,减少神经元的丢失和退行性改变,改善神经功能损伤,表现出脑保护作用。2.GSS通过对新生大鼠脑缺血缺氧后ATP代谢、TCA循环、谷氨酸-谷氨酰胺循环、苹果酸-天冬氨酸穿梭等中间产物以及金属离子、抗氧化剂和磷脂等小分子代谢物的调节发挥脑保护作用。3.GSS可能通过多基因、多蛋白以及多条通路干预新生大鼠脑缺血缺氧损伤过程,发挥脑保护作用