研究背景脓毒症(Sepsis)是由于微生物或其他病原体侵入人体而诱发的过度激烈的全身炎症反应,并对组织具有损伤的病理生理过程及一组临床表现,可发展为严重脓毒症(Severe Sepsis)和脓毒性休克(Septic Shock)。全球每年有超过1800万重症Sepsis的病例。0.3%的发病率起,却以1.5%比率增长,到2020年,在美国每年就会增加100万的病例。现在美国每年有超过75万人患有脓毒症,其中半数以上的脓毒症患者需在ICU入住15.7天左右。脓毒症发生发展过程中,随着难以控制的炎症反应可导致机体多个器官出现急性功能损伤,进而发展为严重脓毒症、脓毒性休克和多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。而肾脏是瀑布式炎症反应的最常攻击器官之一。急性肾损伤(AcuteKidney Injury, AKI)是脓毒症最常见的并发症之一。肾脏损伤后将导致机体内环境紊乱,继而诱发或加重机体其他器官的损伤,导致MODS。尽管AKI在脓毒症患者中有很高的发病率及病死率,然而对脓毒症所致AKI的研究相对较少。研究显示,脓毒症患者如果出现了肾功能轻度受损就可导致其病死率增加；如果在肾小球滤过率(Glomerular Filtration Rate,GFR)仍处于正常或刚出现轻度下降时的AKI阶段就及时进行干预治疗,能够明显降低脓毒症患者的病死率。因此,研究脓毒症患者肾脏早期损伤的病理生理学改变的机制、寻找新的有效治疗脓毒症AKI的方法,是我们目前迫切需要研究的难题。NF-κB是1986年研究者在鼠成熟B细胞和粒细胞瘤中被发现的,并命名为细胞核KapPa轻链基因表达的调节子,后来研究发现其几乎存在于所有的细胞中。目前所知NF-KB/Rel家族成员包括RelA(P65)、RelB、c-Rel、v-Rel、p50、p52等。NF-κB活化后能增强TNFα、IL-1、IL-2基因的转录,使TNF-α、IL-1β和IL 2的产生和释放增加,然后再激活NF-κB。它也可以使IL-6、IL-8这些炎性细胞因子的水平释放增加,进一步放大导致初始炎症的信号,加重机体微循环的损伤,直到DIC或死亡。这种情况在脓毒综合征(Sepsis Syndrome)、急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)更为常见。但这种情况不会无限制地发生在疾病的过程中,因为NF-κB具有负反馈调节作用。白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种非黄酮类的酚类物质。天然的白藜芦醇在很多植物中存在,是植物为了抵御病菌入侵而产生的一种抗毒型物质。白藜芦醇有着强抗氧化能力是一种非合成的植物抗氧化剂,研究显示它能够抑制血小板的聚集、舒张血管、降低血液的粘稠度,对肿瘤的发生也有一定的抑制作用,可以用来治疗冠心病、高脂血症及缺血性心脏疾病。研究还发现白藜芦醇有类似于雌激素的作用,因此也被尝试用于乳腺癌方面的治疗。上世纪90年代,我国也开始了对白藜芦醇的研究,发现其除了对心脏及肿瘤有一定的治疗作用外,还能够起到控制体重,改善微循环等作用。血清肌酐、尿素氮及尿量是衡量AKI的经典标准。前期大量研究数据证实,早期AKI的生物标志物包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil Gelatinaseassociated Lipocalin,NGAL)、肾脏损伤分子-1 (Kidney Injury Molecule 1,KIM-1)、L型脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid-Binding Protein,L-FABP)、α谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase,α-GST)和白介素-18(Interleukin-18,IL-18),这些标志物均在血清肌酐升高前24-48h升高。因此,这些标志物的检测有助于亚临床AKI的判断,并对患者预后的判断有重要意义。近期研究表明,IL-18、NGAL和KIM-1是预测脓毒症AKI相对强烈的信号分子。当多数肾脏发生了急性损伤,尿中生物标志物浓度和比例的增加均要较其在血浆中的水平明显,例如,尿中胱抑素C (Cystatin C)和白蛋白升高,则预示近端小管重吸收功能障碍。近两年来,人们逐渐开始关注循环中的miRNA作为AKI生物标志物。通常,单纯一种生物标志物水平升高越多,且与其他多种生物标志物水平升高的一致性越强,并伴有肾小球滤过率的降低以及尿量的减少时,人们可认为该生物标志物与AKI严重程度和临床预后相关性越强。但仅靠单一的、具有足够敏感性和特异性的标志物也并不能反映AKI病理生理和病情变化的全过程。NF-κB在肾损伤相关疾病中被广泛关注,研究发现肾损伤时NF-κB的表达会上升,进而进展为一系列炎症反应。白藜芦醇因具有抗炎、抗氧化、改善微循环等功效而被广泛关注,近几年被很多学者用于脓毒症治疗方面的动物实验研究,均得出较为肯定的结果,即白藜芦醇可有效改善脓毒症引起的损伤,包括肺损伤、脑损伤等。研究还发现白藜芦醇可改善很多类型的肾损伤,包括糖尿病肾损伤、缺血再灌注损伤、药物相关性损伤等。我们假想脓毒症急性肾损伤时,NF-κB会发生一些变化,但具体怎样变化,受什么因子的调控,白藜芦醇对其干预后会发生什么变化,是我们此次研究主要的目的和方向。研究目的本研究拟通过盲肠结扎与穿孔术(Cecal Ligation and Puncture, CLP)制备大鼠脓毒症诱发AKI模型,是模仿腹腔脓毒症感染的临床过程,引起多菌群感染,最终导致脓毒症。初步探讨白藜芦醇对脓毒症大鼠AKI的保护作用及可能的作用机制,为白藜芦醇应用于脓毒症的临床治疗提供更多的理论基础和实验依据。研究方法1、饲养20只SD雄性大鼠,随机分为Sham组、CLP组两组,采用CLP术建立大鼠脓毒症大鼠模型,分别于CLP术后0h、6h、12h、24h采血,ELISA方法检测比较两组大鼠在不同时间点炎症因子及肾功变化,做病理切片观察大鼠肾脏组织结构变化,以明确12h为脓毒症肾损伤造模成功的时间点。2、饲养50只SD雄性大鼠,体重约为170-220g,随机分为Sham组、Sham+RES(3mg/kg)组、CLP组、CLP+RES (3mg/kg)组与CLP+RES (10mg/kg)组5组,每组10只,做病理切片观察肾脏组织结构变化,采用ELISA方法测小鼠血清肾功能、肾损伤指标,炎症因子变化,计算大鼠生存率,用Western blot法检测NF-κB P65及SIRT1蛋白表达情况,以证实白藜芦醇对肾组织的保护作用。3、使用肾小球系膜细胞进行体外实验,造肾小球系膜细胞LPS模型,再通过白藜芦醇对肾小球系膜细胞进行干预,以及用SIRT1RNAi干扰SIRT1后,用Western blot法分别检测NF-κB P65及SIRT1蛋白表达情况,从而探讨白藜芦醇调控NF-κB P65可能的机制。4、应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。本研究所得到的所有计量资料,都用均数±标准差(X±S)表示,两组以上比较采用方差分析,首先进行方差齐性检验,方差不齐时采用Welch检验结果。多组均数间两两比较：方差齐者用最小显着差值法(Least-significant Difference, LSD),方差不齐者用Dunnett’T3法。P<0.05为差异具有统计学意义。脓毒症合并AKI的生存曲线之间的关系采用Kaplan-Meier;进行检验。结果1.Sham组术后各时间点亚组间血清Scr、BUN、ScysC、NGAL、KIM-1、 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10差异无统计学意义(P>0.05)；而在CLP组中,术后各时间点亚组间血清Scr与BUN、ScysC、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-10随时间延长而升高,与0h比较,有显着的统计学差异(P<0.05)。2. Sham组与Sham+RES组术后组间血清Scr、BUN、、ScysC、NGAL、KIM-1、 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、肾损伤指数、肾动脉血量、GFR浓度差异无统计学意义(P>0.05)；而CLP+RES不同浓度组中则可以清楚看出白藜芦醇干预后的血清NGAL、KIM-1浓度与CLP组比较有明显的下降,并且随RES浓度增加,效果更明显,RES干预组与CLP组比较有显着的统计学差异(P<0.05),而在血清Scr与BUN、ScysC、TNF-α、IL-1β、IL-6、肾损伤指数的检测中,情况也与上述情况类似,在CLP+RES组不同浓度组中则可以清楚看出白藜芦醇干预后的肾血流量与GFR, IL-10与CLP组比较有明显的改善,并且随RES浓度增加,它们的值明显升高,RES干预组与CLP组比较有显着的统计学差异(P<0.05)。3.肾组织病理切片表现为CLP+RES的组别中,肾小球、肾间质及肾小管炎症病变明显减轻,肾组织炎性细胞浸润较相应时间点CLP组减轻,并且生存时间与生存率远高于CLP组,证明白藜芦醇对AKI的控制与逆转有显着的疗效。4.CLP组与Sham组术后组间NF-κBP65蛋白表达水平比较有显着的上调,差异有统计学意义(P<0.05)；而CLP+RES组中则可以清楚看出白藜芦醇干预后的NF-κBP65蛋白表达水平与CLP组比较有明显的下降,RES干预组与CLP组比较有显着的统计学差异(P<0.05)。而SIRT1则相反。5.LPS组较Control组SIRT1蛋白表达水平有显着的下调,差异有统计学意义(P<0.05)；而在LPS+RES组中则可以清楚看出白藜芦醇干预后的SIRT1蛋白表达水平与LPS组比较有明显的升高,RES干预组与LPS组比较有显着的统计学差异(P<0.05)；而对细胞转染SIRT1 RNAi对SIRT1进行阻断后,可以看到SIRT1蛋白表达水平显着下降。6.在NF-κBP65蛋白去乙酰化检测中可以发现,LPS组较Control组NF-κBP65去乙酰化蛋白表达水平有显着上调,差异有统计学意义(P<0.05)；而在LPS+RES组中则可以清楚看出白藜芦醇干预后的NF-κBP65去乙酰化蛋白表达水平与LPS组比较有明显的下降,RES干预组与LPS组比较有显着的统计学差异(P<0.05)；而对细胞转染SIRT1 RNAi对SIRT1进行阻断后,可以看到NF-κBP65去乙酰化蛋白表达水平显着升高。结论1.采用盲肠结扎穿刺(CLP)制备大鼠脓毒症模型,能够复制出急性肾损伤的病理过程。2.白藜芦醇可显着降低脓毒症大鼠的死亡率,通过抑制炎症因子的产生减轻脓毒症急性肾损伤。3.白藜芦醇可通过上调SIRT1促进NF-κBP65去乙酰化,从而减轻脓毒症急性肾损伤。