冻干无细胞膀胱粘膜下基质重建尿道支架的实验研究 尿道下裂是常见的男性泌尿生殖系统先天性畸形，尿道组织缺损是其主要特征。在临床治疗尿道下裂过程中，我们强调基因诊断、内分泌治疗、心理治疗与外科手术相结合的综合治疗措施，其中手术是尿道下裂治疗的关键。常用的再造尿道材料包括：①包皮、阴茎体、阴囊的皮辦；②游离全厚皮片、游离阴囊皮片；③膀胱粘膜、口腔粘膜；④输尿管、动脉、静脉、阑尾组织。但无论采用何种材料修复尿道下裂，都是以新的手术创伤修复缺损畸形，因此我们尝试采用组织工程的方法构建非自体的再造尿道材料，为临床尿道下裂治疗提供崭新的思路。本课题组已经在尿道粘膜细胞、口腔粘膜细胞培养等方面进行了大量的工作，建立了培养细胞和细胞膜片的成功方法。本研究的目的旨在探求天然的细胞外基质支架材料，用于组织工程化尿道的构建。 我们建立了人体膀胱粘膜下层分离、脱细胞、冷冻干燥处理的方法和技术。成功地分离了人体膀胱粘膜下层，并采用反复冻融-酶法对其进行脱细胞处理，获得了无细胞膀胱粘膜下基质，组织学切片HE染色、Masson染色观察和透射电子显微镜超微结构观察证实基质内无细胞成分存在，说明反复冻融与DNA水解酶联合处理膀胱粘膜下层是比较理想的脱细胞方法。Masson染色、天狼星红染色、维多利亚兰染色组织学观察显示无细胞膀胱粘膜下基质主要成分为胶原，Ⅰ、Ⅲ型胶原比值为39∶61，基质中保留了弹性蛋白成分。采用冷冻干燥技术处理无细胞膀胱粘膜下基质得到冻干材料，组织学和扫描电镜观察证实其具有三维立体网络状结构。冻干无细胞膀胱下基质制备完成后应用Co60辐照灭菌，效果可靠，有效期长。Co60辐照冻干无细胞膀胱粘膜下基质的制备技术在国内外尚未见报道。 应用冻干无细胞膀胱粘膜下基质进行了口腔粘膜细胞在基质材料上的体外培养、大鼠腹部肌肉内移植和修复兔尿道缺损的动物实验。采用第二代人体口腔粘膜细胞以2×10~6／ml密度接种于冻干无细胞膀胱粘膜下基质，细胞能够生长和繁殖，14天内在基质材料表面形成了连续单层细胞结构。证实冻干无细胞膀胱粘膜下基质可以在体外诱导粘膜细胞的粘附和生长。将冻干无细胞膀胱粘膜下基质以1cm×1cm面积移植于大鼠腹部肌肉内，组织学观察证实移植基质可以诱导组织细胞浸润、生长，14天内基质移植区血管化，28天内移植基质被机体降解吸收。FITC标记的山羊抗大鼠IgG免疫荧光染色观察显示基质移植后局部无明显IgG免疫复合物的沉积。说明冻干无细胞膀胱粘膜下基质组织相容性良好，可以在体内诱导组织细胞长入和血管化，