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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）是首个完成全基因组测序的病毒,被认为是杆状病毒的模式种。近年来,AcMNPV被广泛用做生物杀虫剂,并被称为安全杀虫剂,但因其杀虫效率较低等局限性从而限制了其作为杀虫剂的广泛使用。近一年来世界十大害虫之一草地贪夜蛾侵入我国,并且预计2020年全面爆发,最先可能遭到迫害的是小麦,其次是玉米等作物。面对如此巨大的粮食安全挑战,需要联合各种防治手段和抗性治理方法,以减少杀虫剂的过度使用,所以寻找一种安全高效的生物杀虫剂刻不容缓。因此,为了提高AcMNPV的抗虫活性,全面了解其基因组中各基因的功能显得尤为重要。AcMNPV基因组中的最后一个开放阅读框AcOrf-154即ac154,基因全长246bp,至今仍无文献报道其在病毒感染过程中发挥的作用。有文献报道在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）中存在ac154的同源基因bm129,敲除此基因获得的重组病毒感染能力增大,但是对其在病毒感染中的具体功能仍然未知。为揭示和明确Ac154在病毒侵染过程中发挥的作用,我们开展了Ac154的功能研究。本研究课题主要包括以下三部分:第一部分:重组杆状病毒vAcac154KO-EGFP、vAcac154KO-Ac154-EGFP和vAc-Ac154-EGFP的构建及Ac154-EGFP的表达分析利用Bac-to-Bac和λ-RED重组系统构建了敲除、回补、过表达重组病毒即vAcac154KO-EGFP、vAcac154KO-Ac154-EGFP和vAc-Ac154-EGFP病毒。分别用5 MOI重组病毒vAcac154KO-Ac154-EGFP和vAc-Ac154-EGFP感染Sf9细胞,荧光定位表明Ac154是在宿主细胞质和细胞核中均有分布的一种蛋白,并且在感染后期主要分布于细胞核中。Western blot结果表明,随着病毒vAcac154KO-Ac154-EGFP感染宿主细胞时间的延长,总蛋白Ac154-EGFP在细胞中的表达量逐渐增加,在108 h p.i.表达量达到最大,且Ac154-EGFP在细胞核中的积累情况与总蛋白的表达趋势一致。vAc-Ac154-EGFP病毒感染的细胞中总蛋白和核蛋白表达趋势一致,Ac154-EGFP蛋白表达量提前达到峰值,在72 h p.i.达到最大,96 h p.i.表达量有所降低。第二部分:Ac154在AcMNPV感染宿主细胞过程中的功能分析首先,通过TCID50的实验方法检测vAcac154KO-EGFP、vAcac154KO-Ac154-EGFP和vAc-Ac154-EGFP子代病毒的产量,结果表明,vAc-Ac154-EGFP可提高子代病毒的产量,ac154的敲除降低子代病毒的产量,ac154的回补使vAcac154KO-Ac154-EGFP的子代病毒产量得以恢复,与vAc-EGFP的子代病毒产量相当。上一章的结果显示vAcac154KO-Ac154-EGFP重组病毒感染的细胞中Ac154-EGFP蛋白表达量在24-108 h p.i.持续增加,在108 h p.i.表达量仍然很高。结合相关文献报道,AcMNPV处理的细胞在48 h p.i.后显示凋亡,所以我们推测Ac154参与宿主细胞的凋亡过程。随后,利用MTT的方法分析重组病毒vAc-Ac154-EGFP对细胞增殖的影响,结果表明vAc-Ac154-EGFP较vAc-EGFP处理组的细胞增殖抑制率更低,在36、48和72 h p.i.分别降低了5.20%,5.01%和2.03%。这一结果表明Ac154促进细胞增殖。据文献报道,AcMNPV的P35是抑制病毒感染引起的Sf9细胞凋亡的主要蛋白,本研究检测了重组病毒对p35转录水平的影响。RT-PCR结果表明,与vAc-EGFP处理组相比,v Ac-Ac154-EGFP能显著的提高p35的转录水平,vAcac154KO-EGFP处理组p35的转录水平降低。结果表明,Ac154能促进p35的转录。为揭示Ac154影响细胞增殖的机制,我们通过Western blot检测了重组病毒对宿主细胞促凋亡蛋白SfP53的影响,结果表明与vAc-EGFP相比,重组病毒vAcac154KO-Ac154-EGFP和vAc-Ac154-EGFP延迟了宿主细胞SfP53的表达。以上结果揭示了Ac154通过调控抗凋亡基因p35和促凋亡蛋白SfP53,延缓细胞的凋亡为子代病毒提供更有利的环境从而促进子代病毒增殖的作用机制。第三部分AcMNPV p35基因缺失对Ac154发挥作用的分析我们已经明确了Ac154在病毒侵染过程中发挥抗凋亡的作用,并且Ac154促进宿主细胞中主要行使抗凋亡作用的p35的转录,那么p35在Ac154发挥抗凋亡作用过程中扮演着什么样的角色?我们构建了敲除p35的重组病毒vAcp35KO-EGFP以及在敲除p35的基础上过表达Ac154的重组病毒vAcp35KO-Ac154-EGFP,分析了vAcp35KO-EGFP和vAcp35KO-Ac154-EGFP处理组在病毒感染过程中对子代病毒和宿主细胞增殖以及宿主细胞促凋亡蛋白SfP53表达水平的差异。结果表明在敲除p35的基础上过表达Ac154的并不会影响子代病毒的增殖。vAcp35KO-Ac154-EGFP感染细胞后,其细胞增殖抑制率会在侵染后期高于vAcp35KO-EGFP,此时过表达的Ac154抑制细胞增殖。Western blot分析了vAcp35KO-EGFP和vAcp35KO-Ac154-EGFP处理组中促凋亡蛋白SfP53的表达情况,发现两个处理组的SfP53的表达仅在侵染中期出现差异。以上结果说明,p35基因的敲除阻断了Ac154在侵染细胞中发挥的抗凋亡作用,p35是Ac154作用的潜在靶基因之一。本研究从细胞水平分析了Ac154在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能,明确了其在子代病毒BV生成过程中发挥的辅助作用,发现Ac154通过调控p35的转录和SfP53的表达来延缓细胞的凋亡,为子代病毒复制争取时间,提供更有利的细胞内环境,从而促进子代病毒的生成。本研究课题的实验结果充实了AcMNPV基因组中调控基因功能的注释,为科学利用杆状病毒AcMNPV防治害虫,开发高效的生物源农药提供了理论基础。