第一部分转录因子GATA2在EGFR/ERK/Elk-1信号通路中的调控作用背景与目的表皮细胞生长因子受体EGFR可以激活下游的信号分子ERK和Elk-1从而促进细胞生存并维持细胞的正常功能。EGFR过度表达后干扰细胞分化的正常调控,与肿瘤侵袭、转移等恶性进展密切相关。转录因子GATA2是锌指结构GATA家族的重要成员,GATA2含有两个锌指,并以此结构与靶基因相结合,从而激活或抑制EGFR通路中靶基因Elk-1的表达。GATA2在血癌、乳腺癌、前列腺癌中高表达已有报告,但胶质瘤中的研究未见报道。本文第一部分旨在研究GATA2在胶质瘤中的表达及调控机制。方法1、培养人脑胶质瘤细胞系SW1783和U87,通过转染GATA2表达质粒及小分子干扰RNA技术(si RNA)分别增强和降低GATA2的表达。2、通过免疫印迹技术(Western Blot)分析GATA2、EGFR、Elk-1在胶质瘤细胞系中的表达。3、以MTT法检测转染GATA2增强表达及siRNA干扰降低表达后对胶质瘤细胞的增殖影响。4、通过微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell试验)检测转染GATA2及si RNA干扰后对胶质瘤细胞迁移及侵袭特征的影响。5、采用Elk-1荧光报告基因检测Elk-1的活性与GATA2的表达水平的相关性。6、将56名多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme;GBM)患者组织标本及6名非肿瘤患者脑组织对照标本进行GATA2免疫组织化学染色。结果1、MTT法检测发现转染GATA2过表达后促进了SW1783细胞的增殖,通过siRNA降低U87细胞GATA2的表达后明显抑制了U87细胞的增殖。2、Transwell试验发现SW1783细胞转染GATA2过表达后迁移和侵袭能力增强,U87细胞经siRNA干扰后GATA2低表达时其迁移和侵袭能力降低。3、在U87细胞中应用EGFR抑制剂AG1478以及ERK抑制剂U0126,免疫印迹技术检测发现GATA2及磷酸化EGFR的表达水平也明显下降;sw1783细胞经100ng/mlegf处理后磷酸化egfr及gata2的表达明显上升,说明gata2受egfr/erk信号通路调控。4、sw1783细胞中gata2过表达后可以上调elk-1(egfr/erk信号通路的下游基因)的表达,u87细胞中sirna干扰后gata2表达下降后同时也下调了elk-1的表达。5、sw1783细胞中elk-1荧光报告基因检测提示elk-1的活性高低与gata2的表达程度呈正相关。6、在胶质瘤组织标本中gata2阳性表达率73.2%(41/56)明显高于对照正常脑组织16.7%(1/6),并且其表达的强度与患者的生存期呈负相关。结论在胶质瘤细胞系和胶质瘤临床组织标本中首次报告了gata2在egfr/erk/elk-1信号通路中的作用是调控胶质瘤细胞的恶性表型,下调gata2的表达后可明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性,为进一步研究用基因敲低的方法治疗胶质瘤找到了新的靶分子。第二部分转录因子foxm1在wnt/β-catenin信号通路中的调控作用背景与目的研究发现foxm1是wnt信号转导通路新的下游靶基因,而且foxm1/β-catenin的相互作用可以激活经典wnt信号途径和维持神经干细胞的自我更新,在高级别的胶质母细胞瘤(gbm)中,foxm1的表达明显高于低级别星形细胞瘤。针对wnt的治疗虽然已有iwp2和lgk974等,但抗癌效果有限,而wnt-c59(c59)作为新型高效的wnt信号调节剂,通过选择性抑制mboat家族成员porcupine介导的wnt蛋白棕榈酰化作用,从而阻断wnt分泌和功能发挥,在乳腺癌研究中收到了高效低毒的良好效果,目前尚无c59在脑肿瘤研究中的报道,本文第二部分旨在探讨c59抑制foxm1/β-catenin后对wnt信号通路及胶质瘤细胞生物学特征的影响。方法1、培养人脑胶质瘤细胞系u87、人脑胶质瘤干细胞系gsc11,通过外源性wnt3a和抑制剂c59分别处理胶质瘤细胞,增强和降低foxm1的表达。2、通过免疫印迹技术(westernblot)分析wnt信号通路β-catenin、foxm1、axin-2、cyclind1在胶质瘤细胞系中的表达。3、双荧光素酶报告基因(top-flash)系统分析c59对胶质瘤细胞中wnt活性的影响。4、实时定量pcr(realtimepcr)检测wnt通路及foxm1受抑制后对相关下游基因cyclind1及c-myc等的影响。5、细胞免疫荧光染色技术分析c59对β-catenin的定位和入核的影响。6、通过干细胞成球实验(neurosphereformationassay)研究c59对胶质瘤干细胞的自我更新、成球能力等干性特征的抑制作用。7、通过细胞划痕试验(woundscratchassay)和transwell实验检测c59对胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力的影响。8、cck-8法绘制细胞生长曲线,观察c59及替莫唑胺(tmz)对胶质瘤细胞的增殖抑制作用。结果1、免疫印迹技术证实wnt3a及c59分别可以上调和下调胶质瘤细胞u87、gsc11中foxm1和β-catenin基因的表达。2、通过westernblot证明c59明显下调u87、gsc11细胞中wnt信号通路及下游基因axin-2、cyclind1的表达。3、双荧光素酶报告基因(top-flash)系统分析显示c59对胶质瘤细胞中wnt活性抑制明显。4、realtimepcr检测证明c59导致wnt相关下游基因cyclind1及c-myc的mrna水平下降。5、免疫荧光染色技术证明c59阻止β-catenin入核,引起细胞核中的β-catenin水平下降。6、wnt抑制剂对胶质瘤干细胞的自我更新、成球能力等干性特征有明显的抑制作用。7、细胞划痕和transwell试验证实c59降低了胶质瘤细胞u87的迁移、侵袭能力。8、c59可显著增强tmz对胶质瘤细胞的增殖抑制作用,联合c59后tmz从25μmol/l浓度开始即可明显抑制肿瘤细胞的生长。结论首次在胶质瘤细胞系和胶质瘤干细胞中用阻断分子信息通路的方法证明wnt通路抑制剂c59可以显著抑制foxm1及β-catenin等基因的表达,从而引起了靶细胞的增殖、迁移、侵袭、自我更新、成球能力等下降,抑制wnt信号通路可以增加胶质瘤细胞对tmz药物的敏感性,对进一步研究用药物阻断调控胶质瘤恶性表型的靶分子表达有重要意义。第三部分wnt/β-catenin/foxm1信号通路阻滞剂c59联合替莫唑胺治疗胶质瘤的体内研究背景与目的一方面,调控胶质瘤恶性进展的信号转导通路不止一条,单一靶分子治疗存在局限性;另一方面,tmz虽然已是胶质瘤治疗临床一线药物,但延长生存期的时间很有限。因此本部分在第二部分体外实验基础上,拟进行wnt信号阻滞剂c59联合tmz治疗胶质瘤的动物体内实验,旨在探讨胶质瘤靶向信号通路治疗与传统化疗联合方案的可行性。方法1、动物模型制作:颅内移植瘤模型,选择5~6周龄纯种balb/c雄性裸小鼠,以水合氯醛行腹腔注射麻醉后,小鼠头顶部切开0.5cm长皮肤,显露颅骨,用25μl微量注射器吸取10μl细胞悬液(含u87或gsc11细胞5×105),在立体定向仪辅助下缓慢(5min)注入鼠右侧尾状核内,骨蜡封闭骨孔,丝线缝合皮肤。2、动物模型分组及给药途径:颅内移植瘤建模成功后将颅内移植瘤实验动物按接种细胞种类分为2大组(U87及GSC11),U87组内及GSC11组内再按照治疗药物分4组,对照组(不给药)、C59治疗组、TMZ治疗组、C59联合TMZ治疗组,第二天开始按组别接受治疗,分别为无药、C59灌胃给药10mg/kg/d共14天、TMZ灌胃给药50mg/kg/d共14天、C59及TMZ灌胃联合用药14天。3、移植瘤体积及肿瘤免疫组化检测:颅内接种细胞后按组别给予不同的药物治疗,第28天处死各组实验动物(每组n=5),取出脑组织,行HE染色观察动物模型的致瘤率并测量肿瘤大小,免疫组化染色检测FoxM1及β-catenin基因在移植瘤中的表达情况。4、荷瘤鼠生存期检测:颅内接种细胞后按组别给予不同的药物治疗(每组n=10),观察记录动物生存期,计算中位生存期(Median),进行生存曲线估计(Kaplan-Meier法)。结果1、颅内移植瘤建模成功后,在早期实验鼠生存状态均良好,28天后发现2只实验鼠出现恶病质体征。2、各组药物抑制移植瘤的增殖。颅内接种后的第28天,处死实验动物行HE染色脑组织发现动物模型的致瘤率为100%。HE染色后测量肿瘤最短径(a)和最长径(b),根据公式计算肿瘤体积V=a2×b/2,结果显示在U87组内和GSC11组内提示C59、TMZ均能抑制裸鼠体内移植瘤的生长,特别是两者联合治疗组的治疗效果最显著。3、荷瘤鼠的生存期:U87组内对照组、C59治疗组、TMZ治疗组、C59联合TMZ治疗组的中位生存期分别为38、54、66、94天,GSC11组内的结果为32、48、52、85天,提示C59、TMZ均能延长荷瘤鼠的生存期,尤其是联合治疗组效果最好。4、免疫组化染色观察FoxM1及β-catenin基因的表达,C59单独及联合TMZ治疗后均可明显下调它们在移植瘤中的表达水平。结论C59联合TMZ治疗颅内荷人脑胶质瘤裸小鼠模型的疗效,从肿瘤体积和荷瘤鼠生存期等方面,比单一C59和单一TMZ的疗效都要好,这对进一步探索胶质瘤靶分子治疗与传统化疗药物联合方案的可行性有重要价值。