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目的HPV16和HPV18被认为是妇女宫颈癌的主要病原,特别是高危型HPV的E6、E7基因被证实为转化基因,在相关组织中稳定表达,具有很强的抗原性,并且,正常组织中不存在这两种蛋白。因此,E6和E7蛋白就成为HPV16相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。本项研究利用DNA改组技术改组HPV16E7基因,构建出HPV16E7的基因突变体库,并成功的构建出真核表达质粒pcDNA3.1- HPV16E7sh,期望从中筛选出免疫原性更高的HPV16E7,为构建新型HPV治疗性疫苗提供重要的理论依据和实验依据。方法1. DNA改组改组模板的制备:我们首先提取标本中的组织DNA,组织DNA提取液-20℃保存。然后用常规PCR法,利用设计的HPV16E7引物,检测上步组织DNA提取液,筛选出阳性标本,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收HPV16E7基因片段,溶于纯水中-20℃保存备用。DNaseⅠ的消化:在30μl酶切反应体系中,加入纯化后的HPV16E7,酶切缓冲液,15℃保温5分钟,再加入0.05U DNaseⅠ,15℃反应2分钟,90℃10分钟终止。消化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,切下50bp左右片段用DNA小片段回收。无引物PCR:在50μl PCR反应体系中,加入10μl酶切后纯化回收的小片段,10×PCR buffer, dNTPs,Taq酶,纯水补足50μl。反应条件: 94℃预变性3分钟, 94℃30秒, 52℃30秒,72℃35秒,,40个循环,72℃延伸10分钟。有引物PCR:取无引物PCR产物1∶100稀释,50μl PCR反应体系中加入引物,上下引物, Taq酶, 5μl稀释后的无引物PCR产物, 10×PCR buffer,dNTPs。反应条件: 94℃预变性3分钟,94℃45秒, 55℃1分钟,72℃1分钟, 20个循环,72℃延伸10分钟。电泳观察,如果条带不清,可取本步的反应产物10μl,进行第二轮有引物PCR,反应条件同上。扩增产物切胶回收约300bp的片段。2. pcDNA3.1- HPV16E7sh质粒的构建及筛选鉴定PCR扩增产物DNA纯化产物及质粒载体pcDNA3.1的酶切限制性内切酶反应在灭菌的0.5ml离心管中进行,在50μl酶切反应体系中,加入HPV16E7DNA(500ng/μl)32μl, BamHⅠ酶,EcoRⅠ酶,1×TangoTM,轻轻混匀, 37℃水浴消化2小时。酶切完成后分别直接从溶液中纯化回收酶切后片段,同样方法双酶切pcDNA3.1。连接反应:连接反应体系: pcDNA3.1酶切产物(100ng/μl)1.5μl,HPV16E7酶切产物(70ng/μl)0.5μl,T4 DNA连接酶(3u/μl)0.2μl超纯水补足10μl,45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。反应条件:15℃水浴12小时。CaCl2法制备E. coli DH5α感受态细胞及重组质粒的转化和筛选鉴定用常规质粒构建方法构建重组质粒,同时做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上。倒置平板于37℃继续培养12-16小时拿出平板,放于4℃数小时,使显色完全。酶切鉴定重组质粒:用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用质粒快速提取试剂盒提取质粒双酶切鉴定回收的质粒。结果1首先用组织DNA提取试剂盒提取10份标本的DNA,得到大片段的组织DNA,然后加入HPV16E7特异引物,利用常规PCR筛选并纯化得到约300bp左右的HPV16E7片段,以纯化后的300bp片段为底物,用DNaseⅠ酶碎片化该片段,得到约50bp左右的DNA片段,将消化后的小片段进行一步无引物PCR,得到一条均匀分布的带状电泳图,无明显集中条带,取上一步的产物稀释后加入带酶切位点的引物,扩增出了300bp片段,与原来的改组模板300bp的HPV16E7一致,我们得到了改组后的HPV16E7,即HPV16E7sh。2利用改组后的HPV16E7与载体pcDNA3.1,构建改组后pcDNA3.1- HPV16E7sh质粒。首先成功的将HPV16E7和pcDNA3.1载体进行BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶的双酶切。然后在DNA连接酶的作用下HPV16E7和pcDNA3.1连接,电泳并回收连接后的大片段。预先制备感受态E. coli DH5α细胞,用pcDNA3.1 -HPV16E7转化感受态E. coli DH5α细胞,然后我们挑取白色单菌落培养12小时后利用质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA,并琼脂糖凝胶电泳观察条带,为了进一步鉴定质粒是否构建成功,我们用BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶双酶切提取的重组质粒,得到了5Kb左右片段和300Bp片段,说明DNA改组后的HPV16E7sh已成功转入pcDNA3.1载体中,重组的真核表达质粒pcDNA3.1-HPV16E7sh构建成功。结论1利用DNA改组技术,在合适的条件下,可以将在自主进化过程中序列比较的HPV16E7基因,进行序列重排,构建HPV16E7基因突变体库,其中可能包括免疫原性更高的新型E7基因,为进一步研究E7基因在宫颈癌,尖锐湿疣等疾病中作用奠定基础。2改组后HPV16E7基因和与载体pcDNA3.1的重组质粒pcDNA3.1-HPV16E7sh的成功构建,为进一步建立高免疫原性HPV16E7基因的筛选模型提供前提,并未进一步构建HPV治疗性疫苗奠定基础。