对于深龋和意外穿髓等患者的治疗,如何保存其患牙的牙髓活力是口腔科医生面临的重要挑战。组织学上,牙体组织由3种硬组织釉质、牙本质、牙骨质和1种软组织牙髓构成,其中,牙本质作为牙体组织主要成分,在保护牙髓、支撑釉质起重要作用。龋病、外伤、磨耗等引起的物理学、化学和生物学作用通过牙本质小管和成牙本质细胞突起而损伤牙髓,轻则引起牙髓的反应性变化、重则引起牙髓的感染和坏死。其中,成牙本质细胞形成第三期牙本质是牙髓的主要防御反应,通过形成第三期牙本质来保护牙髓免受进一步损伤。因此,如何促进损伤牙髓形成第三期牙本质是防止病变进一步发展和保存患牙活力重要的科学问题。第三期牙本质形成的过程包括牙髓干细胞的迁移、增殖和向成牙本质细胞的分化,并分泌牙本质基质。其中牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化是修复性牙本质形成中的重要过程,多种因素、细胞因子和信号通路参与和调控了这个过程。生长因子通过促进成牙本质细胞增殖、分化和功能,进而促进第三期牙本质的形成。研究表明,受伤的牙髓细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)刺激血管生成,通过提高Runx2(Runt-related transcription factor 2)蛋白水平,引起牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达等机制促进成牙本质细胞的增殖和分化,进而促进修复性牙本质形成。VEGF是一个强有力的促进血管生成的细胞因子,具有内皮细胞特异性有丝分裂原活性,在体内能够刺激血管的发生,增加血管的渗透性。因此,应用VEGF有可能通过促进成牙本质细胞增殖和分化、形成第三期牙本质,以保护牙髓。骨形成蛋白2(BMP2),属于TGF-β家族的蛋白质,是一个自分泌蛋白。BMP2具有通过Smad 1/5、p38a MAPK等信号通路促进成牙本质细胞分化和修复性牙本质的形成的作用。成牙本质细胞能产生和分泌BMP2,直接影响分泌和刺激邻近的成牙本质细胞增殖和分化导致牙本质形成。有研究通过促进BMP2蛋白表达或应用外源性BMP2蛋白实现形成修复性牙本质或第三期牙本质。而BMP2蛋白质昂贵,如果应用表达BMP2蛋白的病毒载体有可能通过BMP信号通路促进成牙本质细胞的功能,形成第三期牙本质以保护牙髓。针对第三期牙本质在牙体牙髓病发生、发展和治疗中的作用,根据VEGF、BMP2在牙髓干细胞和成牙本质细胞增殖分化中的作用,在腺病毒介导VEGF和BMP2促成骨作用研究的基础上,提出了我们的研究,即应用腺病毒介导VEGF和BMP2基因转染牙髓干细胞,并检测对牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的影响,并且将腺病毒介导的VEGF和BMP2应用于盖髓的动物实验,研究其对第三期牙本质形成的影响,这将为临床上应用VEGF和BMP2治疗深龋和意外穿髓奠定基础。首先,我们从人脱落乳牙牙髓中采用组织块法经酶消化提取、分离和培养牙髓细胞(人乳牙h DPCs)。所有实验均使用第3代牙髓细胞。在成脂诱导培养基(含IBMX0.5mmol/L、地塞米松1μmol/L、胰岛素10mg/L、消炎痛200μmol/L)内培养35天,油红O染色阳性。在矿化诱导培养基中,茜素红染色阳性。表示所培养的牙髓细胞中含有干细胞,并有一定的分化能力。第二,将携增强型绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad CMV-EGFP)以不同的病毒数量(0、400、800、1000 particles/cell)转导第3代人乳牙h DPCs。在荧光倒置显微镜下观察细胞在转导后的24小时就有EGFP的表达,Ad CMV-EGFP的转导效率随病毒数量的增加而逐渐增加。在病毒量为1000 particles/cell时,细胞增殖没有明显受到影响,细胞的形态无明显变化,病毒转导3d后,转导效率可达70%以上。在以后的实验中,转染Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2时也选择该浓度作为转导条件进行转导。Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2转导后3天的细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增、2%琼脂糖凝胶电泳,观察到h VEGF和h BMP2表达增加,表明Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2已成功转导入细胞内并且有m RNA水平的转录。第三,按照病毒数量为1000particles/cell转导,将Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2对人乳牙h DPCs的作用分别与Ad CMV-EGFP组进行了一系列细胞分子学方面的比较。与Ad CMV-EGFP对照组相比,实验组Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2转导后,在矿化诱导培养基(含抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、地塞米松10-8mol/L)中,培养14天和28天进行茜素红染色,有更多的矿化结节形成。矿化诱导7天、14天和21天均检测到细胞碱性磷酸酶活性增高,有统计学意义(P<0.05)。矿化诱导3天、7天和14天提取细胞总RNA,进行RT-QPCR,结果显示,参与骨生成/牙本质发生相关的基因表达大幅度增加,有统计学意义(P<0.05)。Ad CMV-h VEGF在7天时差异更为显著,Ad CMV-h BMP2则在14天时更显著。第四,在体内,我们制备了第三期牙本质修复的动物模型。将Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2置于大鼠磨牙窝洞内,采用组织学和免疫组织化学观察h VEGF和h BMP2应用对第三期性牙本质形成的作用。体内实验结果同样表明,它们可促进成牙本质细胞增殖和新血管形成,并极大地提高了牙髓中第三期牙本质的形成。本研究采用腺病毒载体介导h VEGF或h BMP2基因转导人乳牙h DPCs,研究了腺病毒载体基因转导h DPCs的可行性,以及h VEGF或h BMP2转导对h DPCs功能的影响。我们的体外和体内的数据表明,Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2可促进第三期牙本质的形成,具有潜在的临床应用价值。本研究的创新点在于将腺病毒为载体的h VEGF或h BMP2转导用于第三期牙本质形成和修复的研究。