第1章引言肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是多因素参与发生发展的高死亡率心血管疾病,肺移植(Lung transplantation)或心肺联合移植(Heart-lung transplantation)是PAH终末期患者唯一有效的治疗策略。基于此,深入探讨PAH的发病机制,为PAH的治疗寻找新的切入点是本领域研究的重要任务。新近研究表明,PAH与癌症发生(Carcinogenesis)在病理生理和发病机制上有诸多相似之处,如细胞过度增殖(Hyperproliferation)和凋亡耐受(Apoptotic resistance),代谢重编(Metabolic reprogramming)等。本研究以野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压为模型,围绕核受体结合SET结构域2(Nuclear receptor binding SET domain 2,NSD2)及其调控的组蛋白赖氨酸甲基化(尤其是H3K36)情况,检测NSD2表达和组蛋白甲基化水平,利用腺相关病毒(Adeno-associate virus,AAV)介导的NSD2沉默,下调NSD2的蛋白表达；采用心脏超声(Echocardiography)和右心微导管(Right ventricular microcatheter)检测心脏功能,同时采用右心微导管检测肺动脉血压变化；利用组织病理学检测肺动脉管壁和右心室心肌的病理改变,以及免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测NSD2的表达定位,探讨NSD2和组蛋白甲基化在大鼠PAH中对肺动脉血压、肺动脉重塑、右心室功能和右心室肥厚的影响作用。利用气相色谱-质谱(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析大鼠肺组织差异性代谢产物,通过组内比较筛选出差异最明显的代谢产物。并进一步利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路富集分析和网状分析(Network analysis),探讨该代谢产物的生物功能及其在PAH的可能作用。最后,利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量测序技术检测PAH组内差异性表达的mRNA；利用基因本体论(Gene ontology,GO)分别从细胞定位(Cellular component,CC)、分子功能(Molecualr function,MF)和生物过程(Biological process,BP)三个角度分析差异性表达基因的富集情况；利用KEGG通路分析探讨差异性表达基因在信号转导通路中的富集情况；利用聚类分析(Clustering analysis),以热图(Heat map)形式筛选可能参与调控PAH的NSD2下游靶基因,为今后验证NSD2在PAH中的调控靶基因及其机制做好准备。为此,本研究以NSD2介导H3K36甲基化为切入点,以代谢组学技术和二代高通量测序技术为支持,围绕NSD2调控代谢重编促进细胞增殖和凋亡耐受促发肺动脉和右心室恶性重构,逐步揭示PAH的发生发展机制,为PAH的预防和治疗策略研究提供实验证据,为相关药物的研发提供思路。第2章NSD2在PAH中的作用及其调控机制目的:探讨在野百合碱诱导的大鼠PAH模型中,下调NSD2表达对肺动脉压、右心室功能的影响；探讨下调NSD2表达对肺动脉及右心室重构的影响；明确NSD2在肺动脉中的表达定位；验证NSD2对组蛋白赖氨酸的甲基化作用；探讨下调NSD2表达对代谢相关因子表达的影响。方法:以野百合碱(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理盐水对照),建立大鼠PAH模型；利用腺相关病毒(AAV)建立NSD2.干扰重组病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null为对照)下调NSD2表达,以重组病毒感染H9C2细胞后检测NSD2 mRNA评价沉默效果,重组病毒(5×1012)经尾静脉注射感染大鼠；实验分为四组:NullMCT组即AAV-Null和MCT注射组；NullSham组即AAV-Null和生理盐水注射组；shNSD2MCT组即AAV-shNSD2和MCT注射组；shNSD2Sham组即AAV-shNSD2和生理盐水注射组；3周后以右心导管测量肺循环血压；左颈动脉导管测量体循环血压；心脏超声心动图检测右心功能和右心肥大；收取肺组织,用于制作组织切片、提取总蛋白和总RNA；以组织学评价肺动脉和右心室重构；采用免疫荧光共聚焦检测NSD2在肺动脉中的表达定位；以实时定量PCR(RT-qPCR)检测代谢相关因子的mRNA表达。结果:(1)成功构建AAV-shNSD2重组病毒:AAV-shNSD2转染H9C2后,NSD2的mRNA表达显著下调。(2)AAV-shNSD2成功感染大鼠:NSD2蛋白表达显著下降。(3)MCT 成功诱导大鼠 PAH(NullMCrvs NullSham；shNSD2MCT VS shNSD2Sham):右心室平均压力(RVMP)、右心室收缩期压力(RVSP)、肺动脉平均压(mPAP)、全肺阻力(TPR)明显升高；右心排量(RVCO)显著降低；体循环动脉压(SBP)和体循环平均动脉压(mSAP)无特异改变；下调NSD2表达显著缓解PAH(shNSD2MCT VS NullMCT):RVMP、RVSP、mPAP、TPR明显降低,RVCO显著升高。(4)MCT促发PAH致右心室重构和右心功能减退(NullMCT VS NullSham；shNSD2MCTvs shNSD2Sham):右室舒张末期内径(RVEDD)、右心室舒张末期容积(RVEDV)、右室收缩末期内径(RVESD)、右心室收缩末期容积(RVESV)、右心室后壁厚度(RVPWT)、室间隔厚度(IVST)明显升高；右室射血分数(RVEF)、右室缩短分数(RVFS)、RR间期校正肺动脉血流加速时间(PAAT/CL)显著降低；下调NSD2表达显著抑制右心室重构、改善右心功能(shNSD2MCTvs Null MCT):RVEDD、RVEDV、RVESD、RVESV、RVPWT、IVST明显升高,RVEF、RVFS、PAAT/CL显著降低。(5)MCT诱导肺动脉中膜增厚和右心室恶性重构(NullMCTvs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham):肺动脉相对厚度(PAMT%)、右心室质量与体重比(RV/BW)、右心室与左心室+室间隔质量比[RV/(LV+S)]明显升高；下调NSD2表达可部分逆转肺动脉中膜增厚和右心室恶性重构(shNSD2MCT vs NullMCT):PAMT%、RV/BW和RV/(LV+S)显著降低。(6)MCT诱导的PAH可见H3K36二甲基化(H3K36me2)水平升高(NullMCT vs Null Sham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下调 NSD2 表达可下调 H3K36me2(shNSD2MCT vs NullMCT)。(7)NSD2主要表达于肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和肺动脉内皮细胞(PAECs)中。(8)MCT诱导的PAH可见葡萄糖转运体1(Glutl)和丙酮酸脱氢酶(PDH)表达降低(NullMCT vs Null Sham;shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；乳酸脱氢酶(LDH)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)和含氧酸辅酶 A 转移酶 1(OXCT1)表达升高(NullMCT vs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下调NSD2表达可下调OXCT1表达(shNSD2MCT vs NullMCT)。结论:NSD2通过催化H3K36二甲基化,参与PAH发生发展,而下调NSD2表达可抑制PAH的发生发展。第3章NSD2调控PAH的代谢组学分析目的:筛选PAH组内差异性代谢产物,探讨差异性代谢产物的调控功能和在PAH中的可能作用。方法:以野百合碱(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理盐水对照),建立大鼠PAH模型；利用腺相关病毒(AAV)建立NSD2干扰重组病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null为对照)下调NSD2表达,以重组病毒感染H9C2细胞后检测NSD2 mRNA评价沉默效果,重组病毒(5×1012)经尾静脉注射感染大鼠；实验分为四组:NullMCT组即AAV-Null和MCT注射组；NullSham组即AAV-Null和生理盐水注射组；shNSD2MCT组即 AAV-shNSD2 和 MCT注射组；shNSD2Sham组即AAV-shNSD2和生理盐水注射组；3周后收取肺组织,提取代谢产物和总蛋白；利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析不同组别大鼠肺组织差异性代谢产物,并筛选出与NSD2表达下调有关的代谢产物；利用KEGG代谢通路富集分析和网状分析,探讨该代谢产物在信号通路中的功能及其在PAH的可能作用。利用Western blot检测白噬相关蛋白的表达。结果:(1)MCT诱导的大鼠PAH可见肺组织内11种代谢产物升高(NullMCT vs Null Sham)；下调NSD2表达后,该11中产物中唯有海藻糖下降(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Shsm vs Null Sham)。(2)海藻糖主要参与的通路包括:ABC转运器、矿物吸收、蛋白消化与吸收、代谢通路、氨酰基-tRNA生物合成、突触囊泡循环、氨基酸合成、氰基氨基酸代谢、植物次生代谢产物生物合成和乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。(3)海藻糖参与PAH可能是通过ABC转运器和代谢通路发挥作用。(4)下调NSD2表达后,促自噬因子LC3-Ⅱ,Beclin1和phos-AMPK表达显著下降,自噬抑制因子P62显著升高。结论:NSD2可能通过调控海藻糖的代谢,以ABC转运器和代谢通路为介导,参与PAH发生发展。海藻糖可能通过调节细胞自噬参与PAH的发生发展。第4章NSD2调控PAH的表达谱分析目的:筛选介导NSD2调控代谢重编的下游靶基因,为后续研究NSD2在PAH中的调控机制研究做准备。方法:以野百合碱(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理盐水对照),建立大鼠PAH模型；利用腺相关病毒(AAV)建立NSD2干扰重组病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null为对照)下调NSD2表达,以重组病毒感染H9C2细胞后检测NSD2 mRNA评价沉默效果,重组病毒(5×1012)经尾静脉注射感染大鼠；实验分为四组:NullMCT组即AAV-Null和MCT注射组；NullSham组即AAV-Null和生理盐水注射组；shNSD2MCT组即 AAV-shNSD2 和 MCT 注射组；shNSD2Sham 组即AAV-shNSD2和生理盐水注射组；3周后收取肺组织,提取总RNA；利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量测序技术检测PAH组内差异性表达的mRNA;利用基因本体论分别从细胞定位、分子功能和生物过程三个角度分析差异性表达基因的富集情况；利用KEGG通路富集分析,探讨差异性表达基因在信号转导通路中的富集情况；利用聚类分析,以热图形式筛选可能参与调控PAH的NSD2下游靶基因。结果:MCT诱导的大鼠PAH可见大量mRNA表达上调的基因(NullMCT vs Null Sham),其中下调NSD2表达可引起以下代谢相关基因mRNA表达下调(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Sham vs NullSham):TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和 TXNIP表达显著降低。结论:TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和TXNIP可能作为NSD2的下游基因,介导NSD2调控代谢重编,参与PAH发生发展。