论文部分内容阅读
目的蓝刺头在蒙医临床中常用于治疗接骨愈伤,但药效物质基础和作用机制尚不明确。本研究以前期化学成分研究为基础,建立蒙药蓝刺头中主要成分的提取工艺,并建立主要成分总含量的测定方法,应用网络药理学分析方法预测蒙药蓝刺头中治疗骨质疏松的关键活性成分、关键生物学通路及重要靶点,同时通过动物实验对蒙药蓝刺头的抗骨质疏松药效以及作用靶点进行验证,初步阐明蒙药蓝刺头抗骨质疏松药效物质基础及作用机制。方法(1)以绿原酸含量和浸膏得率为评价指标,通过单因素考察结合正交试验,建立蒙药蓝刺头中酚酸类成分的提取工艺。(2)选取绿原酸为指标,采用紫外分光光度法,建立蒙药蓝刺头药材中总酚酸含量的测定方法。(3)利用中国知网和Pubmed搜索蒙药蓝刺头的所有化学成分,结合课题组对蒙药蓝刺头化学成分的研究结果,通过Swiss和Superpred数据库建立蒙药蓝刺头的化合物靶点库。搜寻OMIM数据库建立疾病靶点库,并将化合物靶点库与疾病靶点库进行比对,利用Cytoscape建立相应的关联网络模型,通过DAVID在线数据库对共靶的KEGG通路进行分析,以此预测蒙药蓝刺头的抗骨质疏松作用的关键活性成分、关键生物学通路及关键靶点。(4)采用去卵巢大鼠骨质疏松模型和D-半乳糖致大鼠骨质疏松模型,分别分为空白组、模型组、给药组,给药组包括蓝刺头低、中、高剂量组及阳性对照组,给药持续8周,末次治疗后,采集血清和骨骼样本。采用Pet/CT进行骨微结构的检测;ELISA法测定血清骨代谢指标含量;ELISA法测定抗骨质疏松靶点HSD11B1、CYP19A1、ALOX15的表达。结果(1)工艺优化结果:建立了蒙药蓝刺头药材中绿原酸的HPLC含量测定方法,确定了蒙药蓝刺头最佳水提取工艺为12倍蒸馏水,回流提取30min,2次;(2)总酚酸含量测定结果:采用紫外分光光度法,建立了蒙药蓝刺头药材中总酚酸的含量测定方法,并利用该方法确定了药材中总酚酸的平均含量为61.33 mg/g。(3)网络药理学分析作用机制结果:蒙药蓝刺头中28个化合物对应371个靶点,其中关键活性成分可能是槲皮素、芹菜素、咖啡酸和正十六烷酸,主要通过调节氧化应激通路中HSD11B1、CYP19A1、ALOX15的表达很可能是其治疗骨质疏松病的主要作用机制。(4)药效学实验结果:蒙药蓝刺头中、高剂量组可升高去卵巢大鼠血清E2水平,降低血清D-Pry/DPD、TRAP、OC-BGP和PICP的水平,从而降低骨吸收。蒙药蓝刺头可提高D-半乳糖致骨质疏松模型大鼠抗氧化能力,低、中、高剂量组均能降低血清MDA和HYP水平,升高SOD和TAOC水平,中、高剂量组可降低ALP水平。同时,蒙药蓝刺头可明显改善两种骨质疏松大鼠骨微观构造的病理改变,骨小梁的连接性变好,无骨连接的空洞得到恢复;明显改善骨微结构参数的变化,均可提高骨体积/总体积、骨小梁厚度和骨小梁数量,降低骨表面积/骨体积和骨小梁间距;提高骨密度。此外,蒙药蓝刺头低、中、高剂量组均可明显下调两种模型大鼠血中HSD11B1、CYP19A1、ALOX15三个基因的表达量。结论(1)蒙药蓝刺头对绝经后骨质疏松模型大鼠和老年性骨质疏松模型大鼠均有治疗作用,可抑制骨吸收,提高抗氧化能力,改善骨病理改变,改善骨微结构,提高骨密度;(2)蒙药蓝刺头中的苯丙酸类成分(总酚酸)是其重要的抗骨质疏松药效物质基础。(3)下调氧化应激通路中HSD11B1、CYP19A1、ALOX15三个基因的表达可能是蒙药蓝刺头及其总酚酸治疗骨质疏松的重要作用机制之一。