新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于犬、牛、马、羊等多种宿主动物细胞内而引起的一种原虫病。该病对牛的危害尤为严重,主要造成孕畜流产、死胎以及新生犊牛的运动神经系统疾病,已给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。国外学者在新孢子虫的致密颗粒棒状体内以及速殖子表面发现了新孢子虫表面蛋白NcSRS2,NcSRS2表面蛋白介导其粘附及入侵宿主细胞,可以作为酶联免疫吸附试验有效的抗原成分,是最有希望的新孢子虫疫苗的侯选抗原。本研究利用PCR技术扩增和克隆了1 100bp犬新孢子虫吉林株NcSRS2基因片段,对所克隆的NcSRS2基因序列与基因库中已发表的序列(AY940488)进行比较分析。结果表明同源性达到99.8%,证明了该基因片段为犬新孢子虫NcSRS2基因。将NcSRS2基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功构建了融合表达载体pGEX-NcSRS2。将构建好的融合表达载体,在1mmol/L的IPTG诱导下,在大肠杆菌BL21中得到大量表达,经过8 h表达量达到高峰。融合蛋白GST-NcSRS2的分子量为64.4 ku,大部分以可溶性蛋白的形式存在。用亲和层析方法对GST-NcSRS2融合蛋白进行了纯化,获得了理想的纯化结果。经Western blotting免疫印迹分析,融合蛋白与犬新孢子虫阳性血清发生特异性反应,而同刚地弓形虫阳性血清没有交叉反应,说明该蛋白具有很好的抗原性和特异性。本研究应用纯化后的GST-NcSRS2融合蛋白建立了检测犬新孢子虫抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原浓度为4μg/mL、被检血清稀释度为1:40、酶标二抗稀释度为1:2 000为最佳工作浓度。该方法不与牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、牛巴贝斯虫等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法与玄学南等建立的间接ELISA方法平行检测128份牛血清样本,结果表明,所建立方法更加敏感,说明建立的ELISA适用于犬新孢子虫抗体的检测。