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程序性死亡受体1（programmed death-1,PD-1）是主要的免疫反应抑制性分子,在恢复衰竭特异性T细胞的众多策略中尤其关键,针对阻断PD-1及其配体1（programmed death-ligand 1,PD-L1）的肿瘤免疫治疗已成为一种很有价值的治愈炎症和癌症的手段。然而,在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）特别是乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染相关的HCC免疫治疗中,由于HBV相关HCC比非病毒相关HCC的免疫微环境更具免疫抑制和T细胞衰竭现象,微环境中肝癌细胞与免疫细胞之间的相互作用特点和针对性药物尚未能有突破性发现,单一的PD-1或PD-L1阻断并不能取得理想的疗效,因此联合治疗或多靶点效应可能是目前可选的有效策略。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是HBV感染产生的重要炎性介质,与特异性T细胞功能障碍密切相关。微粒体前列腺素E合成酶-1（microsomal prostaglandin E synthetase-1,m PGES-1）是PGE2合成过程中的末端限速酶,靶向抑制m PGES-1兼具抗炎症和抗肿瘤功能,且可以规避环氧合酶（cyclooxygenase,COX）抑制剂的副作用。本课题组前期研究显示HBV X蛋白（HBV X protein,HBx）在转录水平上调m PGES-1表达,促进PGE2分泌,2,5-二甲基塞来昔布（2,5-dimethylcelecoxib,DMC）可以靶向抑制m PGES-1酶活性从而有效下调PGE2的水平,由此表明DMC具备改善HBV相关HCC免疫抑制状态的功能。然而DMC对HBV相关HCC免疫微环境的整体影响、是否同时还具备调节免疫检查点分子的表达,特别是对PD-1/PD-L1通路的独特干预作用等诸多有重要意义的问题均未解决。为此,本课题拟深入探讨DMC在HBx（+）肝癌细胞种植瘤小鼠模型中抑制肿瘤增殖的能力以及检测其对免疫微环境的影响,通过细胞学实验阐明DMC影响HBV相关HCC免疫功能的特殊作用机制,为HBV相关HCC的联合或多靶点免疫治疗提供一种新的策略。本课题第一部分旨在探讨临床HCC患者HBV感染因素与肿瘤免疫效力的关系。应用免疫组织化学技术检测临床HCC组织中CD8和PD-L1蛋白的表达情况,并分析它们与临床病理参数相关性。发现:相比于HBV阴性HCC,HBV阳性HCC组织CD8表达水平明显更低（0.6424±0.05925 vs.6.221±1.071,P<0.001）,而PD-L1表达水平更高（5.566±0.5511 vs.0.5210±0.1034,P<0.001）。临床病理参数相关性分析显示CD8和PD-L1的表达均与HBV感染因素密切相关,而与其他参数均无关。Western blot证实HBV阳性HCC中CD163（肿瘤相关巨噬细胞M2型的标志物）与PD-L1表达正相关,提示HBV阳性HCC中CD163亦是高表达。本课题第二部分旨在探讨CRISPR/Cas9技术构建m PGES-1报告细胞应用于小分子抑制剂的筛选。T7E1实验鉴定出靶向剪切效率最佳的PX459:sg RNA2载体后,与Donor载体共转染构建携带td Tomato基因的m PGES-1报告细胞（呈现红色荧光）。免疫荧光结果显示m PGES-1蛋白（绿色荧光）与红色荧光叠加,共定位成功;Sanger测序证实预期的td Tomato序列成功插入靶基因m PGES-1的终止密码子;流式细胞术显示m PGES-1报告细胞的PE通道荧光强度明显强于野生型细胞,m PGES-1 si RNA转染后荧光则明显减弱。在采用不同的m PGES-1抑制剂处理后,报告细胞的PGE2表达水平和红色荧光强度均呈不同程度的下降,以DMC表现最优,Western blot实验亦证实DMC抑制HBx肝癌细胞PD-L1表达最为明显。本课题第三部分旨在探讨m PGES-1抑制剂DMC对肝癌小鼠模型肿瘤的生长和免疫效力的影响。为此,我们成功构建HBx（+）肝癌细胞种植瘤小鼠模型（接种Hepa1-6/HBx细胞）,分别腹腔注射DMC或/和阿特珠单抗（Atezolizumab）,连续给药一周。结果显示:与对照组相比,DMC或Atezolizumab单药组均能显著抑制肿瘤的生长,瘤组织的CD8表达水平明显增高、PD-L1和CD163的表达水平明显下降,而联合组则呈现出比各单药组更强的作用效果,提示DMC可以通过对PD-1/PD-L1通路和对以M2型TAM细胞为主的免疫抑制细胞的抑制作用改善HBx（+）肝癌的肿瘤免疫微环境。本课题第四部分旨在探讨DMC抑制HBx诱导的肝癌细胞PD-L1表达的作用机制。为此,我们构建过表达HBx的肝癌细胞与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）的共培养体系,并进行DMC处理,流式细胞术检测DMC干预对共培养体系中免疫因素的影响。结果表明HBx能诱导肝癌细胞和免疫细胞的PD-L1表达,并且抑制CD8+T细胞水平,而DMC处理可以逆转这些情况。应用微阵列芯片分析DMC对肝癌细胞信号通路的影响,KEGG分析表明AMPK通路在DMC干预后发挥重要作用;Western blot结果显示DMC激活AMPKα（磷酸化水平增高）,对PD-L1的抑制具有时间和浓度的依赖性,AMPK抑制剂可以回复DMC对PD-L1的抑制作用;此外,免疫共沉淀结果显示PD-L1和AMPKα在DMC处理后互相作用更为明显,证明DMC通过激活AMPKα抑制HBx诱导的PD-L1表达。荧光共聚焦实验发现随着DMC处理时间的延长,PD-L1蛋白逐渐定位在肝癌细胞的内质网上,质谱分析结果提示PD-L1蛋白发生加工异常,IP-Western blot证实DMC通过E3连接酶RBX1的作用导致PD-L1发生泛素化降解。结论:1.与HBV阴性HCC相比,HBV阳性HCC组织中CD8蛋白水平明显更低,而PD-L1蛋白水平更高。临床病理参数相关性分析中,CD8蛋白和PD-L1蛋白仅与HBV因素密切相关,CD163与PD-L1表达正相关。2.m PGES-1抑制剂DMC可以提高HBx（+）肝癌模型小鼠肿瘤浸润的CD8+T细胞水平,抑制肿瘤组织PD-L1和CD163的表达;DMC在HBx（+）肝癌的炎性微环境中能更好地改善免疫效力,主要体现在以PD-L1介导的免疫抑制因素得到更有效的抑制和对以M2型TAM细胞为主的免疫抑制细胞的抑制作用;DMC联合Atezolizumab的抗肿瘤效果更显著,对PD-1/PD-L1通路具有更强的阻断作用。3.DMC通过激活AMPK通路促进HBx诱导的肝癌细胞PD-L1蛋白泛素化降解,且该降解过程由E3连接酶RBX1介导。