论文部分内容阅读
短柄草,新型的禾本科模式植物,基因组比较小,只有272Mbp,与水稻、玉米和小麦具有共线性,亲缘关系上与小麦较近,它们都属于早熟禾亚科。同时,短柄草种植方便,生长周期仅需3个月,自花授粉,易繁殖,且又与水稻和小麦的花器官结构相似。本论文中AGL6（AGAMOUS LIKE 6）、FUL1（FRUITFULL 1）和FUL2（FRUITFULL 2）含有MADS-box保守结构域,均对植物花发育有重要的调控作用。分析研究以上三个基因,初步揭示短柄草的生物学功能,以期为我国禾本科粮食作物遗传育种提供更多的基因资源。本实验室以二穗短柄草花序的cDNA为模板,克隆得到了短柄草BdAGL6、BdFUL1和BdFUL2三个基因的全序列,发现BdAGL6和BdFUL1基因均存在可变拼接,BdFUL2基因不存在可变拼接。BdAGL6转录形成的3个转录本分别为:BdAGL6-1（比BdAGL6-3多7个氨基酸）、BdAGL6-2（比BdAGL6-3多5个氨基酸）和BdAGL6-3,依次构建了BDO1、BDO2和BDO3 3个过表达载体,转化拟南芥;BdFUL1基因转录形成的2个转录本分别为:BdFUL1-1和BdFUL1-2,依次构建了BdF1O1、BdF2O2和BdF2O 3个过表达载体,进行水稻转化。在实验室前期工作的基础上,使用潮霉素（50mg/ml）对转基因拟南芥种子进行抗性筛选,PCR检测和表型分析,初步揭示短柄草BdAGL6基因的生物学功能,比较三个转录本产物功能的异同;同时,在水稻遗传转化的基础上,对过量表达BdFUL1和BdFUL2的转基因阳性植株进行初步的观察分析。本论文的主要研究结果如下:1.对T0代（农杆菌侵染拟南芥当代收获的种子）转基因拟南芥种子进行潮霉素抗性筛选,得到了6个株系的BDO1的T1代种子,9个株系的BDO2的T1代种子,12个株系的BDO3的T1代种子;对T1代的转基因种子进一步筛选鉴定,获得了43株BDO1、84株BDO2和82株BDO3的T2代转基因阳性植株。2.在获得一定数量转基因拟南芥植株的基础上,对开花时间和分支数目进行记录和统计分析,对植株叶片和拟南芥小花进行观察并拍照,对3个基因的表达水平进行检测,从而比较3个转录本产物功能的异同。表型分析发现转基因株系之间均有以下几种表型:花期改变、株型变异、叶型特异和花发育异常。qRT-PCR结果显示:三个转录本的表达水平并未存在显著差异。3.过量表达BdFUL1的水稻植株中,获得了2株F1O1和2株F1O2的转基因株系,再对其表达水平进行检测,同时初步观察阳性株系表型。在转基因水稻阳性植株中,FUL1-1和FUL1-2的表达水平要显著高于野生型水稻植株,但是FUL1-2的表达更强烈。观察分析F1O2转基因水稻植株表型时发现:植株生长矮小,早花,育性低等现象,但是F1O1转基因株系与野生型无显著差异。从而初步推断:BdFUL1-1很可能没有功能,而BdFUL1-2很可能是促使水稻早花以及育性降低的主要原因。当然,我们需要更加充分的证据进一步证明。4.过量表达BdFUL2的水稻植株中,经鉴定获得10株F2O转基因水稻植株。初步观察分析发现:在F2O水稻植株中,BdFUL2表达水平高的植株表现出矮小及早花现象。目前,由于转基因植株数目的局限,需要获得更多的转基因阳性植株,进一步统计其开花时间,以便对早花现象提供充分的证据。综上所述,本论文主要利用遗传学策略和分子生物学手段,初步研究二穗短柄草BdAGL6、BdFUL1和BdFUL2三个基因的生物学功能。分析结果表明:BdAGL6基因的三个转录本功能上存在差异,但是具体的分子作用机制需要更多的证据证明;此外,BdFUL1和BdFUL2在控制植株花器官发育及种子育性方面具有一定的调控作用,但在植株开花时间上需要进一步证实。以上这些试验结果为证实短柄草花发育的分子机制奠定了基础,具有一定的理论意义。