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本研究以蒙脱石(Diosmectite,DS)为载体固定嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus,L.acidophilus),制备蒙脱石-嗜酸乳杆菌复合物(Diosmectite-Lactobacillus acidophilus,DS-L.acidophilus),提高L.acidophilus在酸、胆盐和高温和模拟消化道的存活能力,研究DS-L.acidophilus对2,4,6三硝基苯磺酸(trinitro-benzen-sulfonic acid, TNBS)诱导结肠炎模型大鼠缓解作用。 试验一 DS-L.acidophilus的制备和表征 制备了DS-L.acidophilus并研究了DS重量、L.acidophilus菌液起始浓度和菌液体积对吸附率的影响,优化DS-L.acidophilus制备条件。通过X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、傅立叶变换红外光谱(Fourier Transform infraredspectroscopy, FTIR)和扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)对其进行表征,研究其结构表征变化情况。结果显示,DS的层间距d001并未受到固定菌的影响,与DS原本的层间距无明显差异,吸附过程并未影响DS的层间结构。FTIR图谱结果表明,在1037.82 cm-1处DS-L.acidophilus的Si-O伸缩振动峰向着高能量迁移,1639.75 cm-1处H-O-H的弯曲振动峰向低能量移动,1000~1700 cm-1处L.acidophilus特征吸收峰消失;DS与L.acidophilus表面的水分子之间通过形成氢键相互作用参与吸附过程。扫描电镜观察到,菌体固定在DS表面与黏土颗粒聚成团。通过测定反应体系的不同pH值、离子强度和温度下的吸附率来探究DS与L.acidophilus的作用机理。结果表明,DS对L.acidophilus的吸附率随着pH和离子强度的升高下降,随温度变化先升高后降低,30℃时吸附率最高为50.75%。说明吸附过程受到菌体和蒙脱石表面特性和温度环境条件等影响。 试验二 DS-L.acidophilus抗逆性和模拟消化道实验 研究了活菌浓度对数值log(CFU/mL)为8的三.acidophilus、DS和L.acidophilus混合物(DS+L.acidophilus)和DS-L.acidophilus在低pH(2.0,2.5,3.0)、不同胆盐浓度(0.2,0.4,0.6%)和高温(50,80,100℃)下的L.acidophilus存活能力。结果显示:在pH3.0、2.5和2.0条件下作用2h后,游离L.acidophilus活菌数对数值log(CFU/mL)分别为3.6、2和0.9,DS+L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为5.2、3.2和2.8,DS-L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为7、4.8和4.3;胆盐浓度为0.0%、0.2%、0.4%和0.6%条件下作用2h后,游离L.acidophilus活菌数对数值log(CFU/mL)分别为8.2、3.9、2.5和1.9,DS+L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为8.3、4.1、3.1和2.8,DS-L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为8.5、5.3、4.2和4;耐热实验结果显示,温度为50、80℃条件下作用15 min和100℃条件下作用10 min后,游离L.acidophilus活菌数对数值log(CFU/mL)分别为5.8、3.2和1.8,DS+L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为6.5、3.9和2.2,DS-L.acidophilus活菌数log(CFU/mL)分别为7.1、4.8和2.8,随着pH值降低、胆盐浓度增加、温度的升高和作用时间延长,L.acidophilus、DS+L.acidophilus和DS-L.acidophilus的L.acidophilus活菌数呈下降趋势,游离L.acidophilus活菌数下降最明显,其次是DS+L.acidophilus,DS-L.acidophilus对低pH、胆盐和高温有一定耐受性。模拟消化道结果表明,经模拟消化道处理后菌体存活率为L acidophilus< DS+L.acidophilus< DS-L.acidophilus(P<0.05)。可见DS对菌体有一定的保护作用,但经吸附作用固定后可更好的保护菌体,L.acidophilus存活能力更强。 试验三 DS-L.acidophilus对炎症性肠病模型大鼠的影响选取40只200±20 g的SD大鼠分为4组,每组10只大鼠:正常对照组(Control,Con)、2,4,6三硝基苯磺酸TNBS模型组(TNBS)、DS和L.acidophilus混合物组(DS+L.acidophilus)、DS和L.acidophilus复合物组(DS-L.acidophilus)。除Con组外,其余三组大鼠采用TNBS造模法制备炎症性肠病大鼠模型。造模成功后,DS+L.acidophilus组和DS-L.acidophilus组大鼠分别灌胃500 mg/kg的DS+L.acidophilus和DS-L.acidophilus,Con组和TNBS组灌胃等量生理盐水,连续7天。于第8天大鼠禁食不禁水24小时后用10%水合氯醛麻醉取样,利用Ussing Chamber测定结肠上皮电阻值(TER)和荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FD4)通透性。测定大鼠血浆和结肠黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β,同时进行疾病活动指数(DAI)和病理肉眼损伤和组织学损伤评分,结果表明:与对照组相比,TNBS组大鼠DAI、结肠肉眼和组织学损伤评分显著升高(P<0.05),结肠TER值下降(P<o.05),FD4通透性升高(P<0.05),结肠黏膜SOD活力和GSH含量下降(P<0.05),MPO活力和MDA升高(P<0.05),血浆和结肠黏膜TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著升高(P<0.05),结肠黏膜MUC2,3,4和TFF3 mRNA表达显著下降(P<0.05),DS+L.acidophilus和DS-L.acidophilus均可显著降低(P<0.05)DAI、结肠肉眼损伤评分和组织学损伤评分、FD4通透性和结肠MPO活性和血浆TNF-α、IL-1β和结肠黏膜TNF-α,IL-1β和IL-6的含量,以上指标DS-L.acidophilus优于DS+L.acidophilus。DS-L.acidophilus可增加(P<0.05)结肠TER,降低结肠MDA和血浆中TNF-a和IL-6含量。DS-L.acidophilus增加结肠黏膜(P<0.05) MUC2、MUC3和TFF3 mRNA表达。结果提示:DS-L.acidophilus可有效缓解TNBS诱导的大鼠结肠炎,具有抗炎和抗氧化作用,作用效果优于DS和三.acidophilus的混合物。